石墨烯基季铵盐的制备及其抗菌性能

张 华，孙庆德，王瑞芳，张 雯，张 凤

（天津工业大学改性与功能纤维天津市重点实验室，天津 300387）

石墨烯基季铵盐的制备及其抗菌性能

张 华，孙庆德，王瑞芳，张 雯，张 凤

（天津工业大学改性与功能纤维天津市重点实验室，天津 300387）

为提高氧化石墨烯的抗菌性能，对其进行功能化改性，包括羧基化改性（GO-COOH）和氨基化改性（AG），最终得到石墨烯基季铵盐（GQAS）.通过透射电镜、红外光谱分析、X衍射、X光电子能谱对中间产物和终产物进行了表征，并通过紫外-可见光光谱仪和扫描电镜等测试表征了GO、GO-COOH和GQAS对革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抗菌性能.结果表明：GQAS对大肠杆菌的抑菌率达到86.1%，对金黄色葡萄球菌的抑菌率达到95.3%，是一种有潜力的生物医用材料.

石墨烯；季铵盐；抗菌性能；功能化

石墨烯（GO）是一种由单层碳原子紧密堆积而成的2-D蜂窝状材料，被认为是富勒烯、碳纳米管、石墨（Gt）的基本结构单元[1].石墨烯可用于高速场效应管（FET）包括隧道效应三极管的器件材料、触摸屏、低成本ID卡以及LED、OPV等光电器件，也可作为添加剂用于超级电容器和锂离子电池电极材料，或作为增强剂用于复合材料[2].近期，上海应用物理所物理生物学实验室胡文兵等[3]报道了GO的抗菌特性，发现GO的抗菌性源自于它对大肠杆菌细胞膜的破坏，更重要的是GO对哺乳动物产生的细胞毒性很小.随后，伊朗谢里夫理工大学Akhavan等[4]进一步研究了GO和还原石墨烯（rGO）对革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的毒性作用.新加坡南洋理工大学的陈元教授报道了Gt、氧化石墨（GtO）、GO、rGO的抗菌性能和抗菌机理，并探讨了膜压和氧压对其抗菌活性的影响[5].以上研究表明，石墨烯可以作为有效的新型抗菌材料.季铵盐类抗菌剂也是一种高效抗菌剂，其阳离子吸引带负电荷的细菌细胞壁，长链烷基接触到细菌细胞壁的另一侧，作用于细菌细胞表层，破坏细胞的细胞壁和细胞膜.其作用方式有两种：一种是长链烷基破坏细菌的细胞壁而杀死细菌；另一种是由于受抗菌剂阳离子的吸引，细菌负电荷减少，继而细胞壁破裂，内溶物渗出而死[6].本文为进一步提高GO的抗菌性能，通过改进的Hummers法制备了氧化程度较高的GO，并对其进行季铵盐功能化改性.

1 实验部分

1.1 实验药品与仪器

所用药品包括：石墨（Gt），8 000目，化学纯，天津市光复精细化工研究所产品；2-（7-偶氮苯并三氮唑）-N，N，N，N-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU），分析纯，天津市光复精细化工研究所产品；N，N-二甲基1，3-丙二胺，分析纯，天津市化学试剂研究所产品；五氧化二磷，过硫酸钾，浓硫酸（98%），高锰酸钾，硝酸钠，双氧水（30%），盐酸（36%～38%）等，上海试剂一厂产品；次氯酸，3-氯-1，2-丙二醇，盐酸，蛋白胨，酵母浸粉等，天津市科密欧化学试剂有限公司产品.

所用仪器包括：UECIOR22型傅里叶变换红外光谱仪，德国BRUKER公司产品；K-alpha X型X射线光电子能谱仪，英国Thermo Scientific公司产品；JEM-2010FEF型透射电子显微镜，HitachiS-4800型场发射扫描电子显微镜，日本Nikon公司产品；D/MAX 2500型X射线衍射仪，日本Rigaku公司产品；TU-1901型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器公司产品.

1.2 氧化石墨烯的制备

将40 mL浓硫酸加热至90℃，在机械搅拌的同时加入8.4 g过硫酸钾和8.4 g五氧化二磷，混合均匀后降温至80℃，加入10 g Gt，恒温水浴反应4.5 h.将反应物过滤，并用蒸馏水洗涤残留的酸，置于真空烘箱于60℃烘干，得到预氧化石墨[7].

将5 g预氧化石墨加至130 mL浓硫酸（冰水浴）中，机械搅拌反应30 min；然后加入2 g NaNO3，待固体完全溶解后缓慢加入25 g高锰酸钾，并将温度升高至35℃，反应90 min；用注射器加入230 mL蒸馏水，立即转移到95℃油浴中反应5 min，把混合物倒至2 000 mL的烧杯中滴加12.5 mL 30%双氧水趁热过滤，得到枯黄色固体；加入10%稀盐酸10 mL，洗涤离心3遍，用蒸馏水洗涤至中性；将离心后固体放置于冷冻干燥机中干燥3 d，置于干燥器中保存[8-10].

1.3 羧基化石墨烯的制备

将100 mg GO分散于100 mL蒸馏水中，超声处理1 h，得到均匀溶液.在GO悬浮液中加入1.2 g NaOH和1.0 g氯乙酸，水浴超声2 h，加入适量的稀盐酸得到均匀分散的水溶液[11].再经过滤、水洗、干燥后得到GO-COOH.其化学反应示意如下（其中用3个六圆环替代石墨烯片层）：

1.4 氨基化石墨烯（AG）的制备

将100 mg GO-COOH分散于100 mL DMF中，于30℃机械搅拌下超声1 h，加入10 mL的N，N-二甲基1，3-丙二胺反应1 h，加入10 mg的偶联剂HATU，转入60℃的水浴，冷却回流6 h，用1 600 mL乙醇稀释产物，过滤后得到AG[12-13].化学反应示意如下：

1.5 石墨烯基季铵盐（GQAS）的制备

将100 mg AG分散于100 mL蒸馏水中，加入1 mL质量分数为36.5%的浓盐酸.加入11 g3-氯-1，2-丙二醇，冷凝回流6～7 h.将得到的产物用水和乙醇交替洗涤3次，离心后得到产物[14].化学反应示意如下：

1.6 结构表征

针对干燥至恒重的Gt、GO、GO-COOH、AG和GQAS：在室温下采用UECIOR22型傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）测试其400～4 000 cm-1吸收光谱；采用K-alpha X型X射线光电子能谱仪（XPS）分析其表面元素和含量；采用JEM-2010FEF型透射电子显微镜（TEM）观察石墨烯形貌，加速电压100 kV；采用D/ MAX-2500型X射线衍射仪对其进行X射线衍射（XRD）分析，Cu靶Kα1线，波长为0.154 18 nm，扫描速率为2°/min，扫描范围（2θ）为3°～40°.

1.7 抗菌实验

（1）细菌生长曲线的测定.在固体琼脂板上取单菌落，接种到预先添加有灭菌过的液体培养基的三角瓶中，然后放置在37℃恒温振荡仪中以140 r/min孵育24 h.取5 mL过夜培养的菌液，以10 000 r/min离心5 min，再用灭菌的生理盐水清洗3次，重悬.将200 μL的悬浊液加入到新鲜的LB培养基中，使得菌液最终体积为100 mL，放置到37℃的恒温摇床中以140 r/ min培养，每隔2 h从三角瓶中取样3 mL放入灭菌离心管中，放在4℃的冰箱中储存.直至26 h后，采用TU-1901型紫外可见分光光度计测出所得到溶液的O.D. 600 nm值（波长为600 nm的光密度值）[15-16].以培养时间为横坐标，O.D.600 nm值为纵坐标绘制生长曲线.

（2）抑菌率的测定.按照测生长曲线的办法培养细菌，取1 mL O.D.600=0.1的菌悬液分别和100 μL的无菌水（空白对照组）、抗菌剂混合后，接着转移至15 mL的灭菌试管中，之后加入10 mL的液体培养基.在37.5℃、140 r/min条件下震荡2 h.用200 μL稀释10万倍处理后的菌悬液铺平板，放置在37.5℃恒温培养箱中培养24 h.采用HitachiS-4800型场发射扫描电子显微镜（SEM）观察处理前后细菌的细胞形态.本实验中的抗菌剂有GO（20、50、100、250、500 μg/mL）、GO-COOH（100 μg/mL）、GQAS（100 μg/mL）的水溶液.空白对照实验为加入100 μL的无菌水[17].抑菌率=（空白样的菌落数-抗菌剂处理后的菌落数）/空白样的菌落数×100%[18].

2 结果与讨论

2.1 结构分析

图1所示为各种功能化石墨烯的红外光谱图.

图1 各种功能化石墨烯的红外光谱图Fig.4 FT-IR spectra of GO，GO-COOH，AG and GQAS

由图1可知，GO在3 430、1 725、1 650、1 100、1 050 cm-1处分别为O—H、C—O、C—C、C（O）O、C—C伸缩振动峰.与GO相比，GO—COOH的C—OH峰强度减弱，C—O峰增强，且向高波数移动，峰位置在1 760 cm-1处，说明GO上的羟基向羧基转变.AG在3 400 cm-1处出现N—H的伸缩振动峰，2 924 cm-1处为甲基的C—H伸缩振动峰，1 710 cm-1处为C—O键的伸缩振动峰，1 350 cm-1处为新增的C—N伸缩振动峰，说明氨基化过程中形成了C—N共价键.GQAS在3 430 cm-1处出现O—H的伸缩振动峰，2 924、2 850 cm-1处出现CH3和CH2的C—H伸缩振动峰，1 710 cm-1处为C—O的伸缩振动峰，1 350 cm-1为C—N的伸缩振动峰，由此可知石墨烯基季铵盐具有O—H、CH3、CH2、C—O、C—N等官能团.

图2所示为各种功能化石墨烯的X光电子能谱图.

图2 Gt和各种功能化石墨烯的X光电子能谱图Fig.2 XPS spectra of Gt，GO，GO-COOH，AG and GQAS

由图2可知，在284.4、398.8和531.5 eV处的峰分别归属于碳、氮、氧的特征峰.Gt中氧碳质量比为3.19/ 96.81，GO中氧碳质量比为56.48/43.52，相比Gt而言其氧含量大幅度提高，这主要是因为GO上具有丰富的羟基、羧基、环氧基等.GO-COOH中氧碳质量比为61.05/38.42，其氧含量相对于GO中的氧含量有所增加，主要是由于GO上的羟基和环氧基部分转化成了羧基. AG和GQAS相对于GO-COOH在398.8 eV处出现了氮的特征峰，氮含量分别为5.81%和4.34%，这主要是因为AG上形成了C—N共价键，引入了N元素导致的.GQAS相对AG碳质量分数减少，氧质量分数增加，主要是由于3-氯-1，2-丙二醇被成功地接枝，引入了羟基.

2.2 尺寸大小和晶体结构

图3所示为GQAS的透射电镜图片.

图3 GQAS的透射电镜图Fig.3 TEM micrograph of GQAS

由图3可以看出，GQAS层数较少且透明，卷曲褶皱，仅有几个微米大小.

图4所示为Gt和各种功能化石墨烯的XRD图.

图4 Gt以及功能化石墨烯的XRD曲线图Fig.4 XRD patterns of Gt，GO，GO-COOH，AG and GQAS

由图4可知，天然Gt在2θ=26.5°有个很强的特征衍射峰，是（002）晶面的特征衍射峰，其层间距为d=0.34 nm.GO的特征衍射峰出现在2θ=10.9°，其晶面间距明显增大，为0.81 nm.这是由于浓硫酸的插层作用和高锰酸钾的强氧化作用，使得其面上增加了大量羟基和环氧基等官能团，面间距增大.GO-COOH的特征衍射峰出现在2θ=8.4°，晶面间距进一步增大，为1.05 nm.AG和GQAS无特征衍射峰，主要是由于随着链长的进一步增长，石墨烯片层剥离得到寡层，层间呈无序排列.

2.3 抗菌性能

图5所示为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长曲线图.

图5 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长曲线图Fig.5 Growth curve of E.coli and S.aureus

由图5可知,大肠杆菌4 h后进入对数生长期，14 h后进入稳定期，对数生长区间为4～14 h.与之相对应的金黄色葡萄球菌进入对数期的时间是6 h，16 h进入稳定期，其对数生长区间为6～16 h.

图6所示为经过无菌水、GO、GO-COOH、GQAS等试剂处理后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的平板计数图.

图6 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌平板计数图Fig.6 Plate count photographs of E.coil and S.aureus

由图6可知，处理前大肠杆菌的数目为166个，经过GO、GO-COOH、GQAS处理后菌数分别为105、51和23个，得出GO、GO-COOH、GQAS的抑菌率分别为36.7%、69.3%和86.1%；处理前金黄色葡萄球菌的数目为212个，经过GO、GO-COOH、GQAS处理后菌数分别为100、46和10个，得出GO、GO-COOH、GQAS的抑菌率分别为52.8%、78.3%、95.3%.由此可知，羧基化石墨烯的抗菌性能大于GO，可能是因为其活性氧的含量高于GO，更能抑制细菌生长；而石墨烯基季铵盐的抗菌性能高于GO和羧基化石墨烯，是因为石墨烯基季铵盐具有可破坏细菌壁的季铵盐支链.

图7所示为用GQAS处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌前后的扫描电镜图.

图7 GQAS处理前后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的扫描电镜图Fig.7 SEM images of E.coli and S.aureus before and after having been treated with GQAS

由图7可以看出，处理前大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞结构完整，处理后细菌的细胞形态遭到破坏，特别是金黄色葡萄球菌，几乎全部细胞都遭到破坏.这主要是因为石墨烯片层尖锐的边缘破坏细胞膜，季铵盐的阳离子吸引带负电荷的细菌细胞壁，破坏细菌的细胞壁从而杀死细菌.

3 结 论

本文以水溶性HATU为偶联剂成功制备了AG，同时，制备了高效的碳纳米抗菌剂—GQAS，并对其进行结构表征和抗菌性能分析，研究结果表明：

（1）随着接枝的官能团越多、越长，功能化石墨烯的层间距也逐渐增大，氨基化石墨烯和石墨烯季铵盐片层之间是无序堆叠的.

（2）无论是对大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌，抑菌率大小排序为：石墨烯季铵盐>羧基化石墨烯>GO.

（3）石墨烯基季铵盐对大肠杆菌的抑菌率达到86.1%，对金黄色葡萄球菌的抑菌率达到95.3%，其抗菌性能远高于GO和羧基化石墨烯.

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Fabrication and antibacterial activity of graphene based quaternary ammonium salt

ZHANG Hua，SUN Qing-de，WANG Rui-fang，ZHANG Wen，ZHANG Feng
（Tianjin Municipal Key Laboratory of Fiber Modification and Functional Fiber，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China）

Graphene based quaternary ammonium salt（GQAS）has been fabricated through a series of derivative of graphene such as carboxylated graphene oxide（GO-COOH），amino-functionalization graphene oxide（AG）in the aim of enhancing the antibacterial properties of graphene oxide.The different functionalized GO were characterized by transmission electron microscope（TEM），Fourier-transform infrared（FT-IR）spectroscopy，X-ray diffraction（XRD）and X-ray photoelectron spectroscopy（XPS）.The antibacterial activity to Gram-negative Escherichia coli（E.coli）and Gram-positive Staphylococcus aureus（S.aureus）of GO，GO-COOH and GQAS were compared by UV-Vis spectrometer and scanning electron microscope （SEM）.The results indicated that the antibacterial rates of GQAS are 86.1% and 95.3% to E.coli and S.aureus，respectively.So GQAS is a promising new material for biological and medical applications.

graphene；quaternary ammonium salt；antibacterial activity；functionalization

O613.71；TQ455

A

1671-024X（2015）02-0043-05

2014-12-23

天津市应用基础与前沿计划重点项目（13JCZDJC32100）

张 华（1961—），女，博士，教授，研究方向为抗菌纳米材料.E-mail：hua1210@126.com