临床分离志贺菌中质粒介导磷霉素耐药基因的检测

程 跃，梅 清，刘艳艳，程 君，熊自忠，李家斌，2

临床分离志贺菌中质粒介导磷霉素耐药基因的检测

程 跃1，梅 清1，刘艳艳1，程 君1，熊自忠1，李家斌1，2

摘要目的 在磷霉素耐药志贺菌中检测质粒介导的磷霉素耐药基因fosA、fosA3和fosC2，并分析其传播方式。方法琼脂倍比稀释法测定志贺菌对抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）。在磷霉素耐药菌株中利用聚合酶链式反应（PCR）检测其质粒介导的磷霉素耐药基因fosA、fosA3和fosC2。对阳性扩增产物进行测序分析并对阳性菌株进行接合试验，采用琼脂倍比稀释法测定接合子对12种抗菌药物的MIC值，PCR法检测接合子质粒介导磷霉素耐药基因，肠杆菌科基因间的重复序列PCR（ERIC-PCR）法对阳性菌株进行同源性分析。结果 263株志贺菌中磷霉素耐药25株、中介7株，耐药率为9.5%。PCR结果显示18株磷霉素耐药志贺菌fosA3阳性（基因登录号为KJ716852），阳性率为6．8%，未检出fosA和fosC2。18株fosA3阳性株中，13株结合成功，与受体菌相比，结合子对磷霉素的MIC值明显提高，ERIC-PCR法证实部分fosA3阳性志贺菌具有同源性。结论 首次在临床分离的志贺菌中检测到质粒介导的磷霉素耐药基因fosA3，虽然目前检出率不高，但其传播可造成磷霉素耐药性的扩散，需要加强监测。

关键词志贺菌；磷霉素；质粒；基因

2014－12－10接收

作者单位：1安徽医科大学第一附属医院感染病科，合肥 230022

2安徽省细菌耐药监测中心，合肥 230022

磷霉素是一种广谱杀菌药，通过抑制细菌细胞壁合成的第一步而起到杀菌作用。国外磷霉素主要用于治疗非复杂性下尿路感染，而在我国磷霉素还被用于治疗肠道感染［1－2］。目前志贺菌对磷霉素保持着极高的敏感率，但已有少量对磷霉素耐药的志贺菌在多地区出现［3－4］，阐明这些细菌对磷霉素的耐药机制并及时采取有效措施对保护磷霉素的敏感性和预防耐药菌传播都具有重要意义。目前国内外均未见关于志贺菌对磷霉素耐药机制的研究报道，志贺菌中由染色体介导的磷霉素耐药机制尚不明确，但由于质粒介导的耐药基因可在不同细菌间相互转移［5］，因此，同为肠杆菌科细菌的志贺菌可能从其他类型肠杆菌科细菌中（如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等）获得质粒介导的磷霉素耐药基因。该研究对临床分离的263株志贺菌进行耐药性分析，在磷霉素耐药的志贺菌中检测质粒介导的磷霉素耐药基因，明确耐药基因的种类以及分析其传播方式。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 菌株来源 收集安徽省细菌耐药监测中心2011年9月～2012年10月临床标本中分离的非重复志贺菌263株。所有菌株由全自动微生物分析仪（MicroScan Walk A Way-40）和血清玻片凝集试验鉴定。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922，转移接合试验受体菌大肠埃希菌J53AZR以及fosA、fosA3和fosC2基因阳性标准株均为安徽省细菌耐药监控中心保存菌株。

1．1．2 仪器 PCR仪（德国Biometra公司）；细菌比浊仪（英国Oxiod公司）；多点接种仪（英国AQSManufacturing公司）；小型离心机（美国Thermo公司）；凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；电泳仪和电泳槽（北京市六一仪器厂）。

1．1．3 实验药物 哌拉西林／他唑巴坦（惠氏制药有限公司）；头孢哌酮／舒巴坦（辉瑞制药有限公司）；头孢噻肟、头孢他啶（华北制药河北华民药业有限公司）；头孢曲松（上海罗氏制药有限公司）；庆大霉素、阿米卡星（上海中西制药有限公司）；环丙沙星（广州南新制药有限公司）；左氧氟沙星（扬子江药业集团有限公司）；磷霉素钠（哈药集团三精制药股份有限公司）；氯霉素（上海现代哈森商丘药业有限公司）；亚胺培南（默沙东制药有限公司）。

1．1．4 试剂 Taq酶、10×缓冲液、三磷酸脱氧核糖核苷、DNA Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；M-H琼脂购自英国Oxoid公司；6-磷酸葡萄糖购自美国Sigma公司；麦康凯琼脂购自杭州天和微生物试剂有限公司；志贺菌鉴定多价血清购自兰州生物制品研究所。

1．2 方法

1．2．1 药敏试验 采用琼脂倍比稀释法测定263

株受试菌对上述12种抗菌药物的最低抑菌浓度（the minimal inhibitory concentration，MIC），测定磷霉素MIC时，琼脂平板中加入25 μg／ml的6-磷酸葡萄糖，操作方法及药敏结果判读参照2012年CLSI标准［6］。质控菌为ATCC25922。

1．2．2 细菌DNA模板制备 挑取纯培养菌落于内置双蒸水800 μl的1．5 ml离心管中，100℃水浴12 min，离心（12 000 r／min）8 min，取上清液，－20℃冰箱保存备用。

1．2．3 PCR检测耐药基因 参照文献［7］设计fosA、fosA3和fosC2的引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。利用文献［7］报道的引物与反应条件在磷霉素耐药志贺菌中检测fosA、fosA3和fosC2。PCR阳性产物送上海生工生物工程有限公司进行DNA双向测序并拼接测序结果，测序结果在GenBank中经BLAST程序分析比对。见表1。

表1　PCR扩增引物序列

1．2．4 接合试验 以fosA3阳性志贺菌为供体菌，大肠埃希菌J53AZR为受体菌。用含磷霉素（100 μg／ml）和叠氮钠（200 μg／ml）的麦康凯琼脂平板为选择平板进行接合试验，选择平板上长出的红色细小菌落即为接合子。接合子在选择平板上传代3次后，琼脂倍比稀释法测定结合子的MIC，PCR法检测质粒介导的磷霉素耐药基因。

1．2．5 同源性分析 参照文献［8］，采用肠杆菌科基因间的重复序列PCR（enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR，ERIC-PCR）法对质粒介导的磷霉素耐药基因阳性志贺菌进行同源性分析，利用软件Quantity One 4．5进行相似性分析得出菌株间相似性聚类图，凡相似度值＞85%者为同一亚型［9］，代表同一克隆株；＜85%者为不同的基因型，代表不同的克隆株。

2 结果

2．1 药敏分析 263株志贺菌对磷霉素的耐药率为9.5%，中介率为2.7%。在12种受试药物中氯霉素的耐药率最高达到87.8%，亚胺培南的敏感率最高达到100%，哌拉西林／他唑巴坦和头孢哌酮／舒巴坦的敏感率分别为99.2%和97.0%，仅次于亚胺培南。头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、左氧氟沙星和环丙沙星的敏感率分别为72.2%、50.6%、52.5%、60.5%和64.3%，氨基糖苷类抗菌药物中的阿米卡星和庆大霉素的敏感率较高分别是95.0%和61.6%。见表2。

表2　263株临床分离志贺菌属对12种抗菌药物的耐药率

2．2 磷霉素耐药基因检测 25株磷霉素耐药志贺菌中的18株PCR扩增出大小为282 bp的基因片段。见图1。经测序比对确定为fosA3（基因注册号为KJ716852）。fosA3在263株临床分离志贺菌的检出率为6．8%（18／263），磷霉素耐药菌株中fosA3检出率为72%（18／25）。未检出fosA和fosC2基因。

2．3 接合实验 18株fosA3阳性志贺菌中13株与J53AZR接合成功，接合子鉴定为大肠埃希菌，经PCR扩增及测序证实13株接合子均携带fosA3基因。见图2。接合子的磷霉素MIC值与受体菌

J53AZR相比均有数千倍的提高，接合子的MIC均＞1 024 μg／ml。临床株、接合子和受体菌的MIC值。见表3、4。

表3　fosA3阳性志贺菌对12种药物的MIC值（μg／ml）

表4　接合子和受体菌对11种药物的MIC值（μg／ml）

2．4 ERIC-PCR分析 18株fosA3阳性志贺菌经ERIC-PCR反应，得到清晰指纹图谱，其条带数最多为12条。见图3。利用Quantity One 4．5进行相似性分析得到相似性类聚图。见图4。可见18株fosA3阳性志贺菌中相似度值＞85%的有2164与22106、152与1175、1171与1117以及1120、1139与1189，所以2164和22106为同一克隆株、152和1175为同一克隆株、1171和1117为同一克隆株以及1120、1139和1189三者为同一克隆株，18株fosA3阳性志贺菌可被分为13个克隆株。

3 讨论

志贺菌引起的细菌性痢疾严重影响着人类的健康，有效的抗菌药物治疗是治疗的关键。喹诺酮类药物和三代头孢是治疗细菌性痢疾的首选，本组志贺菌对喹诺酮类药物和三代头孢的敏感率为45.5%～72.2%，与安徽省2005年志贺菌耐药性监测［5］结果相似，可见喹诺酮类药物和三代头孢作为治疗志贺菌感染的首选药物正在逐渐失去优势；氨基糖苷类药物由于体内对志贺菌无效和较强的毒副作用，故并不适用于临床治疗细菌性痢疾；亚胺培南、头孢哌酮／舒巴坦和哌拉西林／他唑巴坦虽然对志贺菌敏感率极高，但昂贵的价格限制了这些药物在临床上的广泛应用。本研究药敏结果显示本组细菌对磷霉素的敏感率为87.5%，高于三代头孢和喹诺酮类药物的敏感率。磷霉素还是一种价格低廉、毒副作用低的药物，因此磷霉素适合被广泛用于治疗细菌性痢疾，尤其是儿童痢疾患者。

本研究首次尝试在25株对磷霉素耐药志贺菌中检测其他肠杆菌科细菌中报道较多的质粒介导磷霉素耐药基因fosA、fosA3和fosC2［7，10］。结果显示25株磷霉素耐药志贺菌中的18株检测到fosA3，未检测到fosA和fosC2。fosA3基因是2009年由日本学者Wachino et al［11］首次在产CTX-M酶的大肠埃希菌中发现。fosA3编码的磷霉素修饰酶FosA3是一种Mn2＋和K＋依赖的谷胱甘肽转移酶，通过催化谷胱甘肽与磷霉素形成复合物导致磷霉素失效，引起耐药［12］。目前fosA3仅在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中被发现［10］。本研究首次在志贺菌中检测到fosA3基因，表明fosA3同样流行于志贺菌中，其流行范围在扩大，需要引起足够关注。本研究在磷霉素耐药志贺菌中仅检测到fosA3，其阳性率达到72%，提示fosA3可能是引起志贺菌对磷霉素耐药的主要机制。fosA3阳性志贺菌的MIC值介于256 ～2 048 μg／ml，而携带fosA3的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的MIC值也＞256 μg／ml［10］，表明fosA3可以导致细菌对磷霉素高度耐药。

对18株fosA3阳性志贺菌进行了接合实验，其中的13株接合成功，接合成功率为72.2%，提示fosA3极易随着质粒在细菌间传播。有报道［13－14］显示fosA3常与其他耐药基因（如blaCTX-M、rmtB、blaTEM等）位于同一质粒上共同传播引起细菌多重耐药。接合试验结果显示12株志贺菌同时将头孢噻肟、头孢曲松的耐药性水平转移给受体菌，提示志贺菌中CTX-M与fosA3可能位于一个质粒上共同传播；1株志贺菌同时将氯霉素、磷霉素、头孢噻肟、头孢曲松、阿米卡星和庆大霉素的耐药性转移给受体菌，这些药物的耐药基因是否位于一个质粒上共同传播有待进一步研究。ERIC-PCR法结果显示18 株fosA3阳性志贺菌可被分成13个克隆株，部分菌株属于同一克隆株，提示在本地区可能存在fosA3阳性志贺菌克隆传播，因此加强传播源和传播途径的控制尤为重要。

本研究首次在志贺菌中检测到质粒介导的磷霉素耐药基因fosA3，并证明其有水平传播和克隆传播的特性，需加强监测。本研究中7株志贺菌虽然对磷霉素耐药但其质粒介导的磷霉素耐药基因检测阴性，推测可能存在染色体介导的磷霉素耐药机制，对其耐药机制的研究将是下一步工作的重点。

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Detection plasmid-mediated fosfomycin resistance genes in clinical isolated shigella

Cheng Yue，Mei Qing，Liu Yanyan，et al
（Dept of Infectious Disease，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

AbstractObjective To investigate plasmid-mediated fosfomycin resistance genes fosA，fosA3 and fosC2 in fosfomycin resistance shigella and analyze its mode of transmission．Methods Antimicrobial susceptibility testing was performed by agar dilution method．Using polymerase chain reaction（PCR）to detect the plasmid-mediated fosfomycin resistance genes fosA，fosA3 and fosC2 in fosfomycin resistance strains．DNA sequencing of gene-positive strains were analyzed and the conjugation experiment was performed．The minimal inhibitory concentration（MIC）of recipient strains and transconjugants were tested by agar dilution method for fosfomycin and other antimicrobial agents．Plasmid-mediated fosfomycin resistance genes in transconjugants were determined by PCR，enterobacterial intergenic consensus PCR（ERIC-PCR）was employed to understand the molecular homology of the fosA3-positive isolates．Results In 263 strains of shigella，resistanc to fosfomycin was 25，intermediate resistance to fosfomycin was 7，resistant rate was 9.5%．PCR results showed that 18 drug-resistant strains fosA3 positive（GenBank accession numbers of fosA3 is KJ716852），positive rate was 6．8%，no fosA and fosC2 gene was detected．The conjugation experiments were successfully carried out in 13 PCR-positive isolates．The MIC of transconjugants against fosfomycin increased differently compared to recipient strains．The homology of partly fosA3-positive isolates was comfirmed by ERICPCR．Conclusion The plasmid-mediated fosfomycin resistance gene fosA3 is first detected in clinical isolates of shigella，although the plasmid-mediated fosfomycin resistance genes are lowly prevalent in clinical isolates of shigella，but these resistance genes can lead to the characteristic fosfomycin resistence transfer，which indicates that more attention should be paid to this phenomenon．

Key wordsshigella；fosfomycin；plasmid；genes

作者简介：程 跃，男，硕士研究生；李家斌，男，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：lijiabin948＠vip．sohu．com

基金项目：安徽省教育厅自然科学基金（编号：KJ2011A180）；安徽省教育厅自然科学基金（编号：KJ2012A177）

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）04－0441－05

中图分类号R 378．2＋5