PRMT2及其剪接体在乳腺癌MCF-7细胞中的亚细胞定位及意义

陈亚军，钟 警，杨 靖，文格波

PRMT2及其剪接体在乳腺癌MCF-7细胞中的亚细胞定位及意义

陈亚军1，2，3，钟 警1，杨 靖1，文格波1

摘要目的 构建蛋白质精氨酸甲基转移酶2（PRMT2）及其差异剪接体与绿色荧光蛋白（GFP）的真核表达载体，转染后观察其融合蛋白在乳腺癌MCF-7细胞中的表达及亚细胞定位，为进一步研究PRMT2基因及其新的差异剪接体在乳腺癌中的作用奠定基础。方法 以pGEM-T-PRMT2／α／β／γ载体为模板，设计引物，PCR扩增目的基因，并将PCR产物克隆至pcDNA3．1／NT-GFP-topo载体，转化后将阳性克隆扩增，对PCR产物进行跑胶鉴定和测序。提取pcDNA3．1／NT-GFP-PRMT2／α／β／γ及空载体pcDNA3．1／NT-GFP质粒，用脂质体介导转染MCF-7细胞，在激光共聚焦显微镜下，观察外源性PRMT2／α／β／γ融合蛋白在MCF-7细胞中的亚细胞定位。采用Western blot法检测各重组融合蛋白在MCF-7细胞中的表达。结果 各GFP在细胞中均有表达，但其在细胞中的分布位置不一致。PRMT2α与PRMT2γ的融合蛋白同PRMT2的分布一致，均聚集于核仁外的核浆，胞质中有少许分布；而PRMT2β和空载体的荧光蛋白的分布一致，都均匀分布于细胞的胞质和胞核，包括核仁部分。Western blot法检测表明各重组融合蛋白在MCF-7细胞中均有表达。结论 PRMT2及其各剪接体的亚细胞定位不同，可能提示其在功能方面存在差异。

关键词乳腺癌；蛋白质精氨酸甲基转移酶2；剪接体；亚细胞定位

2015－01－13接收

作者单位：1南华大学附属第一医院临床医学研究所，衡阳 421001

2南华大学附属第二医院内分泌科，衡阳 4210013南华大学病理生理学教研室，衡阳 421001

乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤，近年来其发病率在我国呈逐年上升趋势［1］。在影响乳腺癌发生、发展和预后的诸多因素中，雌激素起着重要的作用，雌激素能与雌激素受体（estrogen receptor，ER）结合，激活含雌激素反应元件基因的表达［2］。蛋白质精氨酸甲基转移酶2（protein arginine methyltransferase 2，PRMT2）作为一种新的ERα共激活子，在非洲绿猴肾COS-7细胞中能以激素依赖的方式提高ERα的转录活性［3］。本研究在前期工作中发现了PRMT2的3种新的差异剪接体，并分别将其命名为PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ（GenBank登陆号分别为FJ436410、FJ436411、FJ436412）。为了探索PRMT2基因新的剪接体是否与乳腺癌的发生有关，该研究采用基因转染的方法，分别观察PRMT2及其各剪接体融合蛋白在乳腺癌MCF-7细胞株中的表达及亚细胞定位，为进一步研究PRMT2及其新的剪接体在乳腺癌中的作用提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 细胞株、质粒及主要试剂 JM109菌种、pGEM-T-PRMT2／α／β／γ载体均为南华大学附属第一医院临床医学研究所保存；乳腺癌细胞株MCF-7购自中国科学院上海细胞库；阳离子脂质体转染试剂（Lipofect AMINETM2000）、pcDNA3．1／NT-GFP载体、TRIzol试剂均购自美国Invitrogen公司；Blue Ranger预染蛋白分子标准购自美国Hyclone-Pierce公司；Cy3荧光素标记羊抗兔二抗、兔抗人ERα多克隆一抗及辣根过氧化酶购自美国Santa Cruz公司；各种培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Sigma公司。

1．2 细胞培养 MCF-7细胞采用含10%胎牛血清的MEM培养基进行培养，培养基中添加0.1 mmol／L非必需氨基酸、1.0 mmol／L丙酮酸钠、0.01 mg／ml牛胰岛素、1.5 g／L碳酸氢钠，细胞置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养。取对数生长期细胞进行实验。

1．3 PRMT2及其剪接体绿色荧光蛋白（green fluorescent portein，GFP）重组质粒的构建与鉴定 以本实验室保存的pGEM-T-PRMT2／α／β／γ载体为模板，扩增PRMT2基因全长引物为上游：5′-ATG GCAACATCAGGTGACT-3′，下游：5′-TCATCTCCAGATGGGGAA-3′；扩增PRMT2α基因引物为上游：5′-ATGGCAACATCAGGTGACT-3′，下游：5′-TCAACT

GTCATCTCCAG-3′；扩增PRMT2β基因引物为上游：5′-ATGGCAACATCAGGTGACT-3′，下游：5′-TCATCACCCCTCAAGATAT-3′；扩增PRMT2γ基因引物为上游：5′-ATGGCAACATCAGGTGACT-3′，下游：5′-TCATCTCCAGATGGGGAAGA-3′；PCR反应体系为20 μl，其中上下游引物各1 μl，模板1 μl，2×Tag PCR Master Mix 10 μl，超纯水7 μl，PCR仪上扩增。扩增产物连接至pcDNA3.1／NT-GFP-topo vector载体，反应体系为5 μl，其中PCR产物3 μl，topo vector 1 μl，salt solution 1 μl，37℃连接1 h后转化，将筛选的引物进行PCR扩增，跑胶鉴定及测序（宝生物大连有限公司），Blast软件进行比对分析。

1．4 PRMT2及其剪接体蛋白的亚细胞定位观察取对数生长期细胞按3.5×105／孔密度接种于培养板。待细胞贴壁生长融合约50%时，将pcDNA3.1／NT-GFP-PRMT2／α／β／γ及空载体表达质粒转染MCF-7细胞；具体操作参照Lipofect AMINETM2000说明书。48 h后，于室温下细胞用3%多聚甲醛溶液固定10 min，0.1%Triton X-100穿透5 min，含Cy3标记的ERα抗体孵育2 h，DAPI染核3 min，每个步骤开始前均加入PBS冲洗细胞2次，激光共聚焦显微镜观察PRMT2及其剪接体蛋白的亚细胞定位情况。

1．5 Western blot法检测重组融合蛋白的表达用细胞裂解液裂解各组细胞，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度，具体方法参照BCA蛋白定量试剂盒说明书。于100℃水浴10 min，取等量总蛋白SDSPAGE分离，转至硝酸纤维素膜上。TBST（含5%脱脂奶粉）封闭2 h后，加入兔抗人GFP多克隆一抗（1∶1 000）过夜；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶4 000）室温孵育60 min，化学发光试剂盒显色，压片显影，分析PRMT2及其剪接体GFP融合蛋白表达情况。

2 结果

2．1 PRMT2及其剪接体基因扩增 成功扩增出PRMT2及其剪接体基因全长，电泳鉴定PRMT2及其剪接体基因PCR扩增产物。PRMT2扩增条带约为1 300 bp，PRMT2α与PRMT2β对应条带约900 bp，PRMT2γ扩增条带最小，约700 bp，与预计大小基本一致。见图1。

2．2 外源性PRMT2及其剪接体蛋白的亚细胞定位 表达载体分别转染MCF-7细胞，8h后，用激光共聚焦显微镜观察MCF-7细胞中分别转染了PRMT2及其新剪接体的真核表达质粒GFP的表达，结果显示：剪接体PRMT2α与PRMT2γ融合蛋白的亚细胞分布同野生型PRMT2的分布一致，均聚集于核内除核仁外的核浆部分，胞质有少许分布。而PRMT2β则不同，融合蛋白均匀分布于胞质和胞核，包括核仁部分，与空载体GFP蛋白的分布一致。见图2。

2．3 Western blot法检测重组融合蛋白的表达 蛋白经过SDS-PAGE电泳转膜，X线片曝光并显影和定影后观察到转染了pcDNA3.1／NT-GFP-PRMT2／α／β／γ及空载体pcDNA3.1／NT-GFP都检测到了条带，表明各组融合蛋白在MCF-7细胞中的表达成功。见图3。

3 讨论

目前认为，ERα信号途径活性的改变在乳腺癌的发生发展过程中起着重要的作用，而ERα共调节因子的变化，是导致ERα信号途径活性改变的重要原因。正常情况下，雌激素水平在绝经后的妇女中是下降的，而ERα转录活性却在绝经后的乳腺癌患者中表现增强，雌激素主要通过与ERα结合促进乳腺癌的发生发展。目前乳腺癌内分泌治疗主要通过降低体内雌激素水平及抑制雌激素作用，达到抑制肿瘤细胞生长的目的，因此对ERα共调节因子的发现与研究对于指导乳腺癌内分泌药物的有效研发具有重要意义。

PRMT2属于PRMTs的成员之一［3］，在人染色体上定位于21q22．3末端着丝粒的位置，编码433个氨基酸。PRMT2能通过多种机制发挥不同的转

录调节作用，包括转录因子甲基化［4］、组蛋白甲基化［5］、RNA差异剪接等［6］，并参与细胞分化［7］、炎症反应［8］及细胞信号转导［9］等过程。PRMT2所起的多种生物学作用主要依赖于其N-末端的SH3结构域。PRMT2主要通过直接黏附于ERα的AF-1或AF-2等结构域来充当ERα的共激活子，提高其转录活性［3］，然而PRMT2在乳腺癌细胞中的表达形式、调控ERα信号途径的机制，目前尚未清楚。研究［7］表明，PRMT2能阻断IkB-α的核输出，抑制NF-κB依赖的转录，促进细胞凋亡。PRMT2还能与视网膜细胞瘤基因和E2F1结合，形成三体复合物来抑制E2F1转录活性，延缓细胞从G1期至S期的进程，促进细胞凋亡［10］。这些结果均表明PRMT2可通过多种机制发挥不同的转录调节作用。

高等真核细胞可以通过选择性剪接使蛋白质组产生多样性，这是转录后水平调控基因表达的重要机制。从细胞生理、发育调控到疾病的发生发展都与选择性剪接密切相关。近年的研究［11］表明，发生在编码蛋白质基因的差异性剪接与许多肿瘤的形成和发展密切相关，并且有些选择性剪接是肿瘤所特有的。研究选择性剪接的发生以及探索相应蛋白异构体的功能对于肿瘤的诊断和治疗具有十分重要的意义。

为了探索PRMT2基因及其差异剪接体的功能，本研究构建了PRMT2基因及其各差异剪接体的真核表达载体，利用基因转染的方法来初步探讨PRMT2及其剪接体的生物学功能。本研究通过脂质体介导转染后采用Western blot法证实了MCF-7细胞中PRMT2及其剪接体融合蛋白均获得较高表达。转染后48 h，用激光共聚焦显微镜观察外源性PRMT2及其差异剪接体PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ融合蛋白在MCF-7细胞中GFP的表达，结果显示PRMT2及其差异剪接体的融合蛋白在各组细胞中均有表达，但其分布位置不一致。由此推测，PRMT2及其剪接体之间出现的亚细胞定位差异很可能是由选择性剪接引起的。PRMT2各差异剪接体在乳腺癌MCF-7细胞中拥有不同的亚细胞定位，提示其生物学意义可能有所不同。PRMT2新的剪接体在体内的作用如何，是否与其亚细胞定位有关，其差异剪接是否对ERα信号转导途径产生影响，是否将成为一个新的肿瘤标志物，有待于进一步研究证实。

参考文献

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Subcellular localization of PRMT2 gene and its splicings in breast cancer MCF-7 cells

Chen Yajun1，2，3，Zhong Jing1，Yang Jing1，et al
（1Institute of Clinical Medical Research，The First Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang 421001；2Dept of Endocrinology，The Second Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang 421001；3Dept of Pathophysiology，University of South China，Hengyang 421001）

AbstractObjective To construct eukaryotic expression vectors pcDNA3．1／NT-GFP-PRMT2 and its splicings pcDNA3．1／NT-GFP-PRMT2α／β／γ and transfected into breast cancer MCF-7 cells，observe the subcellular localization of GFP-fusion protein in order to investigate the role of PRMT2 and its splicings in breast cancer．Methods The PRMT2 and its splicings genes were amplified from the vectors pGEM-T-PRMT2／α／β／γ，then subcloned into pcDNA3．1／NT-GFP-topo vector and sequenced．The recombinant pcDNA3．1／NT-GFP-PRMT2／α／β／γ，were transfected into breast cancer MCF-7 cells by lipofectamine respectively．The expression of green fluorescent protein was observed under laser scanning microscope，and the expression levels of PRMT2α／β／γ fusion protein were indentified by western blot．Results The expression of GFP fusion protein of PRMT2 and its splicings were observed under the laser scanning microscope，indicating that PRMT2α and PRMT2γ GFP fusion protein resulted in the nuclei except the nucleolus，cytoplasm has diffusion to scatter，as well as that of PRMT2．PRMT2β and N-GFP protein showed scatter homogeneously in nuclei and cytoplasm．Western blot indicated the recombinant PRMT2 and its splicings PRMT2α／β／γ genes were respectively expressed in breast cancer MCF-7 cells．Conclusion The subcellular localization of PRMT2 and its splicings are different and which maybe suggests they that the distinct roles in breast cancer．

Key wordsbreast cancer；protein-arginine N-methyltransferase 2；splicings；subcellular localization

作者简介：陈亚军，女，硕士；文格波，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：wen＿gb ＠hotmail．com

基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目（编号：31200573）；湖南省自然科学基金资助项目（编号：13JJ6051）

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）04－0423－04

中图分类号R 737．9