禽多杀性巴氏杆菌C48-1株OmpA基因表达与抗原性鉴定

高明燕，胡茂志，沈欣悦，周 生，徐 步

（1.中国农业科学院家禽研究所，江苏扬州225125;2.扬州大学

江苏省物质微区与性能测试服务中心，江苏扬州 225009）

禽多杀性巴氏杆菌C48-1株OmpA基因表达与抗原性鉴定

高明燕1，胡茂志2，沈欣悦1，周 生1，徐 步1

（1.中国农业科学院家禽研究所，江苏扬州225125;2.扬州大学

江苏省物质微区与性能测试服务中心，江苏扬州 225009）

为了研究禽多杀性巴氏杆菌（Pm）外膜蛋白A（OmpA）的免疫原性，根据C48-1菌株OmpA基因序列设计一对特异性引物，采用PCR方法扩增去信号肽的成熟OmpA基因.将去信号肽的成熟OmpA基因扩增片段双酶切后，克隆到pGEX-6p-1表达载体中，构建重组表达质粒pGEX-OmpA，转化宿主菌BL21并经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达.SDS-PAGE的结果显示，融合蛋白GST-OmpA大小约为63 ku，与预期的分子质量相符.免疫印迹分析结果表明，该融合蛋白与鸡抗Pm血清具有明显的免疫反应，说明OmpA具有良好的抗原性，这为禽Pm OmpA在免疫防御研究中的应用奠定了基础.

禽多杀性巴氏杆菌;外膜蛋白A;原核表达;免疫印迹

禽霍乱，又称禽巴氏杆菌病、禽出血性败血症，是一种侵害家禽和野禽的急性、败血性传染病，是养禽业中重要的细菌性传染病之一，给养禽业造成了严重的经济损失［1］.多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）是禽霍乱的病原菌，主要以荚膜抗原和菌体抗原区分血清型，荚膜抗原分为A、B、D、E、F等5个血清型;菌体抗原分为16（1－16）个血清型［2］.禽Pm的血清型主要为A:1、A:3、A:5，我国分离到的菌株血清型以 A:1 为主［2－3］.

外膜蛋白A（outermembrane protein A，OmpA）是普遍存在于革兰氏阴性菌表面的蛋白，具有维持细胞膜的稳定性、保证物质运输的功能，并在细菌对宿主的感染、致病和免疫中都起着重要的作用［4］.目前，关于革兰氏阴性菌，诸如大肠杆菌、克雷伯氏菌等的OmpA在免疫调节等方面功能的研究与发现较多［5－6］，而Pm OmpA的免疫作用以及免疫功能等相关研究还非常少.已知Pm OmpA具有免疫原性，能够在小鼠模型上诱导抗体产生，但在家禽体内的免疫功能和作用还缺乏了解［4］.本课题组前期研究发现，国内禽Pm标准强毒株C48-1与其他多个国内禽分离株的OmpA基因序列的同源性高达100%;进一步证实禽Pm OmpA基因序列非常保守［7］.因此为进一步深入研究OmpA的功能，本试验选择C48-1菌株，以其OmpA基因为研究对象，进行原核表达和抗原性分析，旨在为禽Pm OmpA的免疫与致病功能研究提供生物材料.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及质粒 C48-1菌株源自中国兽医药品监察所;大肠杆菌DH5α、BL21以及原核表达载体pGEX-6p-1由本课题组保存，pMD18-T购自宝生物工程（大连）有限公司.

1.1.2 试剂 EX-Taq聚合酶、限制性内切酶、连接酶、异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG）、X-Gal均为宝生物工程（大连）有限公司产品;DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、质粒DNA小量抽提试剂盒、DNA Marker、SOC肉汤、LB肉汤、LB琼脂、氨苄青霉素钠（Amp）等购自生工生物工程（上海）有限公司;预染蛋白Marker购于Fermentas公司;酶标羊抗鸡IgG为Bethyl公司产品;免疫印迹相关试剂均为北京康为世纪生物有限公司产品;鸡抗Pm阳性血清由本课题组制备.

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 参考前期测定的C48-1菌株OmpA基因的核苷酸序列，针对成熟蛋白（去掉信号肽）基因设计一对特异性引物，并在上下游引物分别加入BamHⅠ、SalⅠ的酶切位点（下划线），由生工生物工程（上海）有限公司合成.

1.2.2 细菌基因组DNA的制备 将Pm菌株C48-1接种在BHI液体培养基中，于37℃、100 r·min－1振荡培养12 h，按照DNA抽提试剂盒的说明书提取细菌DNA.

1.2.3OmpA基因的扩增 PCR扩增体系50μL，含25μLPremix Ex Taq混合物、1μLDNA模板、上下游引物各2μL、20μL ddH2O.PCR扩增条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环;72℃延伸10 min.采用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物.

1.2.4 重组表达质粒的构建及鉴定 用BamHⅠ和SalⅠ双酶切去信号肽OmpA基因扩增产物和pGEX-6p-1质粒，胶回收两个片段后用T4连接酶连接，转化大肠杆菌BL21.挑取阳性克隆，提取质粒，将酶切鉴定正确的重组质粒pGEX-OmpA送金斯瑞生物有限公司测序.鉴定正确的重组菌命名为BL21（pGEX-OmpA）.

1.2.5 重组菌的诱导表达 将重组菌BL21（pGEX-OmpA）振荡培养4 h，菌液的D600nm为0.4－0.6时，加入终浓度为0.1 mmol·L－1的IPTG诱导表达4 h.将诱导表达的细菌裂解产物进行SDS-PAGE电泳鉴定，同时用只含有空载体的重组菌BL21（pGEX-6P-1）作为阴性对照.

1.2.6 免疫印迹分析 诱导表达的蛋白经SDS-PAGE分离后，按常规方法转膜;转移后的NC膜在5%的脱脂乳中于4℃封闭过夜，用PBST洗膜3次，每次5 min;加入1∶500倍稀释的鸡抗Pm阳性血清孵育1 h后，弃去一抗，用PBST洗膜3次，每次5 min;再与辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG（1∶1000）孵育1 h，然后弃去二抗，用PBST洗膜3次，每次5 min;最后用DAB显色液显色.

2 结果与分析

2.1 OmpA基因的扩增与克隆

用所设计合成的特异性引物扩增C48-1菌株DNA，扩增片段大小为1000 bp，与预期结果一致.随机挑选白色菌落的阳性克隆进行培养，提取质粒，经BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，可见2600和1000 bp的条带（图1），与理论结果一致.测序证实，成熟OmpA基因长度为999 bp，序列正确.

2.2 重组表达质粒的鉴定

提取重组表达质粒pGEX-OmpA，经BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定得到4900和1000 bp两个片段.经测序证实序列与方向正确（图2）.

图1 Pm菌株成熟OmpA基因的扩增结果Fig.1 PCR result of Pm strainsmature OmpA gene

图2 重组质粒pMD18T-OmpA和pGEX-OmpA的双酶切鉴定Fig.2 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pMD18T-OmpA and pGEX-OmpA

2.3 重组菌的诱导表达和表达产物的鉴定

IPTG诱导的重组菌BL21（pGEX-OmpA）的裂解产物经SDS-PAGE电泳后，在63 ku处出现一条特异性蛋白条带，与预期的融合蛋白大小一致;未诱导的细菌未出现明显的蛋白条带;而空载体细菌BL21（pGEX-6P-1）裂解物在26 ku处出现明显的GST条带（图3）.免疫印迹结果表明，表达的融合蛋白能够与鸡抗Pm阳性血清呈免疫反应，而空载体对照与阳性血清没有反应条带，由此推定表达的蛋白与细菌菌体的OmpA具有相似的抗原性（图4）.

图3 重组菌的SDS-PAGE结果Fig.3 SDS-PAGE of recombinant bacteria

图4 表达产物的免疫印迹分析结果Fig.4 Western blotting analysis of expressing product

3 讨论

Gatto et al［8］研究显示，Pm提纯的OmpA具有很强的免疫原性，能诱导小鼠产生显著的抗体;Dabo et al［9］报道，原核表达的OmpA能够引起小鼠强烈的Th2类免疫反应，诱导产生高水平的IgG1抗体;Lu et al［10］制备的OmpA单克隆抗体被动免疫实验动物的结果表明，攻毒后接种动物死亡率下降.本试验也发现，经原核表达的Pm OmpA能够与Pm鸡抗血清产生免疫反应，说明原核表达的OmpA与细菌本身的OmpA具有相似的抗原位点，能够利用其进行免疫和致病等相关功能的研究.

OmpA属跨膜蛋白，其全基因表达产物（也称前蛋白）由于带有信号肽，能够引导前蛋白整合到大肠杆菌外膜中，从而引起大肠杆菌外膜失去原有的完整性和稳定性，导致大肠杆菌死亡引起表达失败.因此，本试验选择去掉信号肽的成熟OmpA进行表达的方案，因对大肠杆菌不产生干扰作用从而获得了成功表达.

4 结论

本试验成功构建了pGEX-OmpA重组表达质粒，诱导表达了OmpA-GST融合蛋白;免疫印迹分析结果表明，该融合蛋白具有良好的免疫原性，为进一步研究OmpA在疾病防治中的应用奠定了基础.

［1］SAIF Y M.禽病学［M］.12 版.苏敬良，高福，索勋，译.北京:中国农业出版社，2012.

［2］DZIVA F，MUHAIRWA A P，BISGAADM，etal.Diagnostic and typing options for investigating diseases associated withPasteurellamultocida［J］.Vet Microbiol，2008，128:1 －22.

［3］吴范庚.我国多杀性巴氏杆菌血清学鉴定及交互免疫试验［J］.中国兽医杂志，1997，23（8）:14－15.

［4］TAMASH，KEITH A H，JOHN D B，et al.Outermembrane proteins ofPasteurella multodida［J］.Vet Microbiol，2010，144:1－17.

［5］STEPHEN G J，MAHON SV，MATTHEW A，etal.A molecular Swiss army knife:OmpA strucutre，function and expression［J］.FEMSMicrobiol Lett，2007，273:1 －11.

［6］JEANIN P，IOVANIGM，ILIANE LG，et al.outermembrane protein（OmpA）:a new pathogen-associated molecular pattern that interactswith presenting cells in pact on vaccine strategies［J］.Vaccine，2002，20:24 －27.

［7］高明燕，徐步，龚建森，等.11株禽多杀性巴氏杆菌OmpA基因克隆测序及其序列分析［J］.浙江农业学报，2013，25（5）:951－956.

［8］GATTO N T，DABO SM，HANCOCK R E，et al.Characterization of，and immune responses ofmice to，the purified OmpA-equivalent outermembrane protein ofPasteurellamultocidaserotype A:3（Omp28）［J］.VetMicrobiol，2002，87:221 －235.

［9］DABO SM，CONFER A W，MONTELONGO M，et al.Vaccination withPasteurella multocidarecombinat OmpA induces strong but non-protective and deleterious Th2-type immune response inmice［J］.Vaccine，2008，26:4345 －4351.

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（责任编辑:施晓棠）

Prokaryotic expression and antigenicity analysis of the OmpA gene of avian Pasteurella multocida strain C48-1

GAO Ming-yan1，HU Mao-zhi2，SHEN Xin-yue1，ZHOU Sheng1，XU Bu1
（1.Poultry Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Yangzhou，Jiangsu 225125，China;2.Jiangsu Test and Service Center for Material Microanalysis and Property，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China）

According to the nucleotide sequencing resultof outermembrane protein A（OmpA）gene ofPasteurellamultocida（Pm）C48-1 strain，a pair of primers were designed.ThematureOmpAgene of C48-1 strain was amplified by polymerase chain reaction technique and then cloned into prokaryote expression vector pGEX-6p-1 for sequence analysis.The recombinant plasmid，pGEXOmpA was then transformed intoE.coliBL21.After induction with Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside（IPTG），SDS-PAGE and western blotting results showed that the fusion protein GST-OmpA was about63 ku and could be detected by chick serum against Pm.So，itwas suggested that the OmpA protein was a immunodominance antigen in the process of Pm infection and could be used in the study of immune protection against Pm.

avianpasteurellamultocida;outermembrane protein A;prokaryotic expression;Western blotting

S852.61

A

1671-5470（2015）03-0289-04

10.13323/j.cnki.j.fafu（nat.sci.）.2015.03.012

2014－01－13

2014－10－11

公益性行业（农业）科研专项（201303044）;江苏省家禽科学研究所青年科学基金项目（JQ201102）.

高明燕（1978－），女，助理研究员，硕士.研究方向:禽病防治.Email:gmy_stella@sina.com.通讯作者徐步（1964－），男，研究员，硕士.研究方向:禽病防治.Email:bu_xu@yahoo.com.cn.