以啤酒废弃物为原料发酵Bt培养基的响应面优化

吴丽云

（1.福建省微生物研究所/福建省新药（微生物）筛选重点实验室，福建福州 350007;2.福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福建福州 350002）

以啤酒废弃物为原料发酵Bt培养基的响应面优化

吴丽云1，2

（1.福建省微生物研究所/福建省新药（微生物）筛选重点实验室，福建福州 350007;2.福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福建福州 350002）

采用单因素试验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验和响应面分析对苏云金芽孢杆菌（Bt）高产毒力培养基进行快速优化，得到的最优配方为:以啤酒原污水为溶液，添加 0.2%葡萄糖、0.05%ZnSO4、0.1%（NH4）2SO4、0.15% 吐温 80、0.4%A 物质、0.6%NaCl、0.12%KH2PO4、30%酵母液.优化后的芽孢数提高了 5.1 倍，芽孢数达 10.86 ×108cfu·mL-1，D595nm（晶体蛋白含量）为0.258.

啤酒原污水;Plackett-Burrman设计;响应面优化;培养基

虫害是制约农作物高产、稳产的重要因素，每年因虫害造成的经济损失高达1200亿美元［1］.苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）具有高度专一性，对人类、动物和植物无害，可降低害虫抗性，是我国研究和应用较为成功的绿色生物农药，但其生产成本高于化学农药，限制了它的应用推广.一般商业培养基的价格约占总生产成本的35%-59%［2］，原料价格是成本高的主要原因之一，寻找廉价的替代培养基显得尤为重要.鉴于此，本试验以啤酒废水发酵培养Bt，采用单因素试验、Plackett-Burman（PB）设计、最陡爬坡试验和Box-Behnken响应面优化快速筛选出最佳的培养基，以降低Bt的生产成本，减少污水处理费用.

1 材料与方法

1.1 菌株

BRC-WLY1为本实验室从啤酒厂污水处理系统中分离的Bt菌株.

1.2 培养基

LB 液体培养基:5 g·L-1酵母粉、10 g·L-1蛋白胨、10 g·L-1NaCl，pH 7.0-7.2.

发酵培养基:啤酒原污水（即1/2啤酒废水+1/2啤酒酸化水）、葡萄糖、ZnSO4、（NH4）2SO4、A物质、KH2PO4、NaCl、酵母液、吐温 80.其中，葡萄糖、A 物质、（NH4）2SO4单独灭菌 20 min，吐温 80、酵母液、ZnSO4、NaCl、KH2PO4与啤酒原污水混合，调节pH至7.5，灭菌40 min后，按要求于无菌条件下混合.

1.3 种子与发酵培养

一级试管培养:接种保藏的菌株1环于装有5 mL LB液体培养基的试管中，振荡培养18 h.

二级三角瓶种子培养:取两支一级试管培养的试管种子液，转接于盛有50 mL LB培养基、50 mL酸化池污水的500 mL三角瓶中培养8 h，选取菌体整齐、强壮，未形成芽孢的种子转接.

发酵培养:取500 mL三角瓶，加入发酵培养基100 mL，接种5 mL二级种子液，在30℃、160 r·min-1、初始pH为7.5的条件下，摇瓶发酵培养至90%芽孢脱落为止，下架检测.

1.4 指标检测

晶体蛋白含量（D595nm）参照王善利等［3］的方法测定;发酵结束后芽孢采用血球计数板计数.

1.5 培养基优化试验

1.5.1 单因素试验 以啤酒原污水为基本培养基，分别加入不同营养物质组成培养基，添加的营养物质如下.

碳源:0.4%丙酮酸钠、0.4%乙酸铵、0.4%葡萄糖、0.4% 甘油、0.4% 柠檬酸、0.4% 蔗糖、2% 玉米粉、2%大米粉、0.4%A物质、0.2%果葡糖浆.

氮源:0.2%谷氨酸、0.2%精氨酸、0.2%甘氨酸、0.2%酪氨酸、0.2%亮氨酸、0.2% 组氨酸、0.2%缬氨酸、0.2%蛋氨酸、0.2%胱氨酸、0.2%丝氨酸、0.2%苯丙氨酸、0.2%（NH4）2SO4、0.2%NaNO3、2% 黄豆饼粉、2%蛋白胨、1.5%尿素、2%大豆蛋白胨、0.2%玉米浆、20%酵母液.

金属离子:0.05%FeSO4、0.05%MnSO4、0.05%ZnSO4、0.05%CuSO4、0.2%KH2PO4、0.2%CaCO3、0.05%MgSO4.

生长促进剂:0.2%吐温 80、0.2%植物油、0.75%NaCl、0.2%啤酒厂洗糟水.

BRC-WLY1菌株在相同条件下发酵，发酵结束后，以啤酒原污水为参比，考察不同单因素对芽孢数和晶体蛋白含量的影响，进行单因素筛选.

1.5.2 PB设计 在单因素营养因子筛选的基础上，选对培养基影响较大的8个因素，选次数n=12的PB设计，考察各因素主效应和交互作用的一级作用，确定重要的影响因素.

1.5.3 最陡爬坡试验与响应面优化试验 根据PB设计得出一次拟合方程来安排最陡爬坡试验.以晶体蛋白含量为响应值Y，以最陡爬坡试验得到的A物质、酵母液、KH2PO4作为SAS软件优化中心点，安排响应面优化试验［4］.获得试验数据后，进行二次回归拟合，得到交互项和平方项的二次方程.将优化试验所得的数据与响应面模型进行拟合，最后在一定水平范围内求出最佳值［5］;再按所得的参数进行试验，以验证模型的可靠性，并确定最后的优化结果.上述试验随机次序进行，均进行两次，对应的响应值取两次试验结果的平均值.

采用SAS 9.0软件对试验结果进行分析.

2 结果与分析

2.1 碳源、氮源、金属离子和生长促进剂的优化结果

2.1.1 碳源的影响 从图1可以看出，在啤酒原污水中分别添加蔗糖、葡萄糖、A物质发酵后产生的芽孢数和晶体蛋白含量均较高，产生的芽孢数与玉米粉接近，高于啤酒原污水;晶体蛋白含量仅次于柠檬酸和啤酒原污水，高于粮食类原料（图1、2）.啤酒原污水本身成本很低，考虑原料成本则尽量选择粮食类原料，因此，可选择蔗糖、葡萄糖、A物质为碳源作进一步优化.但进一步研究发现，加入蔗糖的发酵周期较长，且晶体蛋白小且不规则，其生产效益及毒力差，因此选择A物质和葡萄糖为碳源作进一步试验.与啤酒原污水相比，加入A物质和葡萄糖，可提高芽孢数，但晶体蛋白含量略有降低，需要对氮源进一步优化.

2.1.2 氮源的影响 从图3、4可以看出，除谷氨酸、组氨酸、缬氨酸外，在啤酒原污水中添加其他氨基酸均有利于晶体蛋白的合成，晶体形状大且规则.其中，添加苯丙氨酸、酪氨酸、酵母液的晶体蛋白含量增加较为显著;添加酵母液的晶体蛋白含量和芽孢数均较高.

图1 碳源对晶体蛋白含量的影响Fig.1 Effect of different carbon sources on crystal protein production

图2 碳源对芽孢数的影响Fig.2 Effect of different carbon sources on spore number

图3 氨基酸对晶体蛋白含量的影响Fig.3 Effect of different amino acids on crystal protein production

图4 氨基酸对芽孢数的影响Fig.4 Effect of different amino acids on spore number

从图5可以看出，与啤酒原污水相比，添加无机氮NaNO3，复合氮黄豆粉、蛋白胨、玉米浆的晶体蛋白含量降低，其他无机氮和复合氮均有利于晶体蛋白的合成，尤其是添加酵母液、（NH4）2SO4的效果最显著，但芽孢数不如添加粮食类原料.

从图6可以看出，加入无机氮和复合氮均有利于芽孢生成.在试验过程中发现添加粮食类原料形成芽孢较迟，发酵周期延长，而添加氨基酸成本较高.酵母液是啤酒生产废弃物，含多种复合氮源和生长因子，来源广泛、易得，且成本低，故选择酵母液、（NH4）2SO4作为氮源.2.1.3 金属离子的影响 从图7、8可以看出，除CuSO4外，在啤酒原污水中添加其他金属离子均有利于提高晶体蛋白含量.其中，KH2PO4、ZnSO4对晶体蛋白含量的影响较显著，且有利于芽孢的生成.故选择KH2PO4、ZnSO4作为金属离子添加剂.

图5 无机氮和复合氮对晶体蛋白含量的影响Fig.5 Effect of nitrogen sources on crystal protein production

图6 无机氮和复合氮对芽孢数的影响Fig.6 Effect of nitrogen sources on spore number

图7 金属离子对晶体蛋白含量的影响Fig.7 Effect of differentmetal ions on crystal protein production

图8 金属离子对芽孢数的影响Fig.8 Effect of differentmetal ions on spore number

2.1.4 生长促进剂的影响 从图9、10可以看出，与未添加生长促进剂的啤酒原污水相比，添加吐温80、NaCl对提高晶体蛋白含量和芽孢数有利，故选择吐温80、NaCl作为生长促进剂.

图9 生长促进剂对晶体蛋白含量的影响Fig.9 Effect of different growth accelerants on crystal protein production

图10 生长促进剂对芽孢数的影响Fig.10 Effect of different growth accelerants on spore number

综上结果，选取葡萄糖、A 物质、（NH4）2SO4、酵母液、KH2PO4、ZnSO4、吐温 80、NaCl等 8 个因素，采用PB设计、SAS软件进一步优化.

2.2 PB设计筛选重要影响因子

采用SAS9.0软件对PB各因素进行分析的结果（表1）表明，酵母液、A物质、吐温80 3个因素对晶体蛋白含量的影响极显著（可信度大于95%）.各因素对晶体蛋白含量的影响可用如下方程表示:Y=0.225712-0.000788x1-0.004879x2+0.002455x3+0.00797x4+0.003545x5+0.003955x6+0.002879x7-0.004303x8，该方程的决定系数R2为 96.93%.

由表2可知:（NH4）2SO4、葡萄糖对晶体蛋白含量的影响较小，且葡萄糖的影响呈负效应，为了便于培养基的配制，取0.2%（NH4）2SO4;（NH4）2SO4对晶体蛋白含量的影响呈正效应，取上限［0.1%（NH4）2SO4］;ZnSO4、吐温80、NaCl、KH2PO4对晶体蛋白含量的影响显著，其中，吐温80呈负效应，取下限（0.15%吐温80），NaCl、ZnSO4 呈正效应，分别取 0.6%NaCl、0.05%ZnSO4;酵母液、A 物质、KH2PO4对晶体蛋白含量的影响极显著，A物质呈负效应，而酵母液、KH2PO4呈正效应.综上所述，取0.2%葡萄糖、0.6%NaCl、0.1%（NH4）2SO4、0.05%ZnSO4、0.15%吐温80，并以 A 物质、酵母液、KH2PO43 个显著因子为中心点进行响应面优化.

表1 n=12的PB的试验设计与结果Table 1 Matrix and results of PB design

表2 主要因素与水平设计Table2 Design of themain factors and levels

2.3 最陡爬坡试验结果

由表3可见，在x+2△X、x+3△X处的晶体蛋白含量最大.为了方便配置培养基，取0.4%A物质、26%酵母液、0.1%KH2PO4为SAS软件优化的中心点.

表3 最陡爬坡试验设计及结果Table 3 Design and result of the steepest ascent experiment

2.4 响应面优化结果

2.4.1 试验设计与结果分析 Box-Behnken设计的矩阵试验安排及试验结果如表4、5所示.

运用SAS 9.0软件对15个试验点响应面值进行数据分析，得回归二次多项式拟合方程:Y=0.255+0.003875X1+0.002125X2+0.00225X3-0.006375X21-0.00275X1X2-0.0015X1X3-0.001875X22-0.0005X2X3-0.002625X23.回归总模型F-检验极显著（P模型=0.006682 ＜0.01），失拟项不显著（P=0.872492 ＞0.2）（表6）.该模型决定系数R2=0.9562，修正决定系数Adj-R2=0.8775，表明此模型拟合程度良好［6-7］，说明方程与实际情况较相符，3个因素及二次项能解释Y变化的95.62%，可用于Bt产晶体蛋白发酵培养基优化的理论预测.由表6可知，回归方程中线性项和二次项极显著（Pr分别为0.004405 和0.005901 ＜0.2），交叉项（Pr=0.10188 ＜0.2）在90%水平上显著，说明响应面分析所选3个因素及各因素之间交互作用是Bt产晶体蛋白发酵中的关键控制因素.

表4 中心点3个因素和3个水平取值Table 4 Values of 3 factors and 3 levels of center point

表5 发酵优化试验Box-Behnken设计矩阵和响应数据Table 5 Testmatrix and response values of Box-Behnken design

表6 模型方程Y的方差分析Table 6 Anova analysis ofmodel equations of Y

2.4.2 回归模型Y岭脊分析和最适浓度的获取与验证 对Y响应面回归非线性模型求一阶偏导，令其等于零，得三元一次方程组，解该方程组得Y最大值时所对应X和3个因子最优试验点代码值（表7）.

表7 响应面回归非线性模型的岭脊分析Table 7 Ridge analysis for response surface regression model

对Y模型进行响应面分析，得到晶体蛋白含量最高时的最佳培养基浓度:X1为0.4%;X2为29%;X3为0.12%，D595nm的预测值 =0.25614.考虑培养基配制方便，选择 0.4%A 物质、30% 酵母液、0.12%KH2PO4，即以啤酒原污水为溶液，添加 0.2% 葡萄糖、0.4%A 物质、30% 酵母液、0.12%KH2PO4、0.1%（NH4）2SO4、0.05%ZnSO4、0.15% 吐温 80、0.6%NaCl.

为了检验模型预测的准确性，对原始条件的啤酒原污水和响应面优化的最佳培养基进行对比和验证试验，重复3次取平均值.原始条件的D595nm为0.194，芽孢数为1.78×108cfu·mL-1;响应面优化后的D595nm为 0.258，芽孢数为10.86 ×108cfu·mL-1，试验值与模型计算值分别相差 +0.72%、+3.88%，可见预测值与平均值非常接近，说明回归方程能较真实反映各筛选因素对晶体蛋白含量的影响，预测模型能较好地反映发酵实际情况，优化后的芽孢数提高了5.1倍.

3 讨论

通过单因素试验、PB设计筛选出最重要的3个因素，并通过响应面法优化，得到最佳培养基配方:以啤酒原污水为溶液，分别添加 0.2% 葡萄糖、0.4%A 物质、30% 酵母液、0.12%KH2PO4、0.1%（NH4）2SO4、0.05%ZnSO4、0.15%吐温 80、0.6%NaCl.优化结果与实际试验结果吻合较好，优化后的芽孢数提高了5.1倍.证明用D595nm建立模型，PB设计能有效地从众多的因素中筛选出最为重要的因素，响应面拟合显著性好（95%以上）.本试验实现了以啤酒原污水为原料的Bt培养基优化，为啤酒原污水培养微生物提供良好的方法.

以污水、污泥为原料培养 Bt菌株，其芽孢数为（108-109）cfu·mL-1［8］.Pham et al［9］采用响应面优化氧化预处理后的污泥用于HD-1菌株发酵，芽孢数达4.08×108cfu·mL-1.Khanh et al［10］采用污水、淀粉废水培养基培养HD-1菌株48 h，最高芽孢数达2×109cfu·mL-1.Lachhab et al［11］以污水、活性污泥为原料发酵培养HD-1和Bta菌株，芽孢数达4.8×109cfu·mL-1.常明等［12］以污泥为原料摇瓶培养Bt 48 h，芽孢数最大值达8.51×108cfu·mL-1.吴丽云［13-14］考察2008年1整年啤酒废水、城市污水化学耗氧量的变化情况的结果表明，与城市污水相比，啤酒废水具有高且稳定的化学耗氧量、可生化性强等特点，适宜作为Bt的发酵培养基;以啤酒废水为原料发酵Bt，活芽孢数为（108-109cfu·mL-1），最高达4.4×109cfu·mL-1，对2-3龄小菜蛾幼虫的毒力较城市污水培养的发酵液高.本试验在笔者前期研究的基础上，以分离自污水处理系统的Bt菌株BRC-WLY1为出发菌株，采用啤酒原污水为基础培养基，通过优化培养基，在未添加粮食类原料的条件下，芽孢数达到1.086×109cfu·mL-1，属较高水平，且发酵周期短，仅24 h左右，应用前景广阔，说明将响应面优化方法应用于啤酒原污水发酵Bt培养基的方案可行.

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（责任编辑:施晓棠）

Optim ization of brewery wastesmedium for Bt incubation by response surfacemethodology

WU Li-yun1，2
（1.Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products/Fujian Institute of Microbiology，Fuzhou，Fujian 350007，China;2.Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology，Ministry of Education，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China）

Culturemedium for high yield ofBacillus thuringgiensis（Bt）was optimized by single factor experiments，Plackett-Burman design，the steepest ascent experiment and response surfacemethodology.The optimized culturemedium was obtained as follows:brewery wastes water，0.2%glucose，0.05%ZnSO4，0.1%（NH4）2SO4，0.15%tween 80，0.4%material A，0.6%NaCl，0.12%K2HPO4，and 30%yeast fluid.The spore production was 5.1 times increased up to 10.86 × 108cfu·mL-1，andD595nmof protein productionwas 0.258 under optimized condition.

brewery waste water;Plackett-Burrman design;response surfacemethodology optimization;media

TS205.5

A

1671-5470（2015）03-0313-07

10.13323/j.cnki.j.fafu（nat.sci.）.2015.03.017

2015-01-14

2015-03-25

福建省自然科学基金资助项目（2011J0101）;福建省教育厅科技项目（JA11346）.

吴丽云（1966-），女，副教授，高级工程师.研究方向:发酵工程.Email:lywu66717@163.com.