多硫代二酮哌嗪类化合物C87体外对肿瘤细胞生长的抑制作用及对活性氧产生的影响

高艺洋, 魏晓莉, 杨晓雯, 任凤霞, 郑建全, 郑志兵, 苏瑞斌

(1. 广西医科大学药学院, 广西 南宁 530021; 2. 抗毒药物与毒理学国家重点实验室,军事医学科学院毒物药物研究所军事毒理与生化药理研究室, 北京 100850)

多硫代二酮哌嗪类化合物C87体外对肿瘤细胞生长的抑制作用及对活性氧产生的影响

高艺洋1,2, 魏晓莉2, 杨晓雯2, 任凤霞2, 郑建全2, 郑志兵1,2, 苏瑞斌1,2

(1. 广西医科大学药学院, 广西 南宁 530021; 2. 抗毒药物与毒理学国家重点实验室,军事医学科学院毒物药物研究所军事毒理与生化药理研究室, 北京 100850)

目的 研究多硫代二酮哌嗪类化合物C87对肿瘤细胞生长的影响及其可能机制。方法 用磺酰罗丹明B法观察C87 0.05～1 μmol·L-1与A549，HCT116，HeLa和SMMC7721作用24，48和72 h对肿瘤细胞存活率的影响，并计算50%生长抑制浓度(GI50)；用流式细胞术检测C87 0.1～2.5 μmol·L-1作用HCT116和HeLa细胞6 h, C87 2.5 μmol·L-1作用0～6 h活性氧(ROS) 的生成量；用流式细胞术检测C87 2.5 μmol·L-1伴随给予抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)作用HCT116和HeLa细胞6 h ROS的生成量；用SRB法观察C87 0.05～1 μmol·L-1伴随给予NAC作用24和48 h对HCT116细胞存活率的影响。结果C87 0.05～1 μmol·L-1作用24，48和72 h，可明显抑制A549, HCT116, HeLa和SMMC7721细胞存活(P<0.05)，且具有浓度依赖性(72 h，r2=0.946，0.989，0.973和0.984 ，P<0.05)；C87 1 μmol·L-1与上述4种肿瘤细胞作用24, 48和72 h能时间依赖性地抑制细胞存活(r2=0.983，0.956，0.951和0.873,P<0.05)。C87 0.25～2.5 μmol·L-1与HeLa细胞和HCT116细胞作用6 h，可诱发细胞内ROS产生，且呈浓度依赖性 (r2=0.760,P=0.045;r2=0.987,P=0.001)；C87 2.5 μmol·L-1作用0.5～6 h，诱导ROS的产生呈时间依赖性 (r2=0.886,P=0.017;r2=0.994,P=0.000)。给予抗氧化剂NAC后能明显抑制C87引起的HeLa细胞和HCT116细胞ROS生成(P<0.05 )，NAC 5和10 mmol·L-1可明显逆转C87引起的HCT116细胞死亡，GI50值明显增大，作用24 h时GI50为1.446和1.134 μmol·L-1(C87处理组为0.513 μmol·L-1)；处理48 h时GI50为0.882和1.166 μmol·L-1(C87处理组为0.333 μmol·L-1)。结论 化合物C87对A549, HCT116, HeLa和SMMC7721肿瘤细胞的生长具有抑制作用，其机制可能与其诱导细胞内氧化应激有关。

多硫代二酮哌嗪类化合物; C87; 肿瘤细胞, 培养的; 活性氧

多硫代二酮哌嗪类化合物 (epipolythiodioxopiperazines, ETP) 是由真菌产生的一类次级代谢产物，具有广泛的生物学活性，包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫抑制及抑制多种酶活性(如拓扑异构酶、酪氨酸激酶、ATP合酶)等[1-5]。ETP类化合物以含有硫桥键的二酮哌嗪母核为结构特征，硫桥键是其生物活性的关键基团，去除或断裂硫桥通常会导致其生物活性丧失[6-9]。因ETP类化合物结构新颖，立体化学独特，骨架类型多样，所以其活性研究一直备受关注。

近年来，本研究集体从真菌次级代谢产物中获得多个新的ETP类化合物。前期体外细胞实验研究显示，多个化合物对多种肿瘤细胞生长具有明显的抑制活性，其中C87对肿瘤细胞生长的抑制作用最为明显。因此，本研究在细胞水平评价ETP类化合物C87(图1)的抗肿瘤活性，并探讨其可能的作用机制。

Fig.1 Chemical structure of novel epipolythiodioxopiperazine compound C87.

1 材料与方法

1.1 药品、细胞、试剂和仪器C87为从冬虫夏草定殖真菌黏帚霉素属(Gliocladium sp.)的发酵产物中获得的ETP类化合物，以高效液相色谱法测定其纯度为95%。人肺癌A549细胞和人结肠癌HCT116细胞分别由本研究所王玉霞研究员和关勇彪研究员馈赠；人宫颈癌HeLa细胞和人肝癌SMMC7721细胞由本实验室保存。DMEM高糖培养基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 购自美国Gibco公司；三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)、磺酰罗丹明B(sulforhodamine B, SRB)、二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO) 和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC) 购自美国Sigma公司；活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。CKX41倒置显微镜和BX51荧光显微镜，日本Olympus公司；GENios Pro多功能酶标仪, 澳大利亚Tecan公司；FACS Calibur流式细胞仪, 美国BD公司；BS214D电子天平, 德国Sartorius公司；MCO-15AC二氧化碳培养箱，日本Sanyo公司。

1.2 细胞培养A549, HCT116, HeLa和SMMC7721细胞培养于含有10%FBS的DMEM培养基 (高糖)，置于37℃，5%CO2的细胞培养箱内培养，待细胞生长至80%融合时，用0.25%胰酶消化、传代，取对数生长期细胞进行以下实验。

1.3 SRB法检测肿瘤细胞存活率

1.3.1 C87对肿瘤细胞存活率影响的检测将处于对数生长期的A549, HCT116, HeLa和SMMC7721细胞，消化后制成细胞悬液，调整细胞密度为A549细胞5×107L-1，HCT116细胞7×107L-1，HeLa细胞5×107L-1，SMMC7721细胞6×107L-1，每孔100 μL接种于96孔板内，培养24 h后弃培养基，每孔加入用DMEM培养基稀释的不同浓度C87 (终浓度0.05, 0.1, 0.25, 0.5和1 μmol·L-1)100 μL，每组设3复孔，对照组加入含0.1%DMSO的DMEM 100 μL，继续培养24，48和72 h后弃培养基，每孔加入10%TCA溶液100 μL固定细胞，4℃放置1 h，弃上清，用去离子水洗涤4次。干燥后每孔加入0.4%SRB溶液100 μL，室温下孵育30 min，弃上清，用1%醋酸溶液洗涤5次。干燥后每孔加10 mmol·L-1Tris溶液 (pH=10.5)100μL溶解，低速摇床上振荡10 min，酶标仪562 nm波长下处测定各孔吸光度(A562 nm)。细胞存活率(%)=(实验组A562 nm-空白孔A562 nm)/(对照组A562 nm-空白孔A562 nm)×100%。

1.3.2 抗氧化剂对C87抑制肿瘤细胞存活影响的检测将处于对数生长期的HCT116细胞经消化后制成细胞悬液，调整细胞密度为7×107L-1，每孔100 μL接种于96孔板内，培养24 h后弃旧培养基，一组中每孔加入含有抗氧化剂NAC(5 mmol·L-1)的DMEM培养基100 μL处理30 min后，加入用含有NAC(5 mmol·L-1)的DMEM培养基稀释的不同浓度C87 100 μL，C87终浓度为0, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5和1 μmol·L-1；另一组中每孔加入用DMEM培养基稀释的不同浓度C87 100 μL，C87终浓度为0, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5和1 μmol·L-1，对照组加入含有0.1%DMSO的DMEM培养基，每组设3复孔，具体方法同1.3.1。

1.4 流式细胞术检测细胞活性氧的产生

1.4.1 C87对肿瘤细胞活性氧产生影响的检测取对数生长期的HCT116和HeLa细胞接种于6孔板中培养 (每孔3×105)，培养24 h后弃旧培养基，每孔加入用DMEM培养基稀释的不同浓度C87(终浓度0.25, 0.5, 1和2.5 μmol·L-1)2 mL，对照组不加药物，更换新鲜培养基。每组设3复孔，继续培养0.5，2，4和6 h后消化细胞，用旧培养基终止消化，200×g离心4 min，弃上清。用无血清培养基稀释2′,7′-二氯荧光乙酰乙酸盐 (2′,7′-dichlorofluoresceindiacetate，DCFH-DA)，使其终浓度为10 μmol·L-1，用稀释好的DCFH-DA悬浮细胞，37℃细胞培养箱内孵育20 min，每隔3～5 min颠倒混匀一下。用无血清培养基洗涤细胞3次后细胞重悬于无血清培养基中。用流式细胞仪检测，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm，测量荧光强度。

1.4.2 抗氧化剂对C87诱导肿瘤细胞活性氧产生影响的检测取对数生长期的HCT116和HeLa细胞接种于6孔板中培养 (每孔3×105)，培养24 h后弃旧培养基，一组中2孔加入含有抗氧化剂NAC(5 mmol·L-1)的DMEM培养基2 mL处理30 min后，其中一孔弃旧培养基后加入用含有NAC(5 mmol·L-1)的DMEM培养基稀释的C87(2.5 μmol·L-1)2 mL；另一组一孔加入用DMEM培养基稀释的C87(2.5 μmol·L-1)2 mL，对照组加入含有0.1%DMSO的DMEM培养基，继续培养6 h，具体方法同1.4.1。

2 结果

2.1 C87对不同组织类型肿瘤细胞存活率的影响图2结果表明，肝癌SMMC7721、人肺癌A549、

2.2 C87对不同组织类型肿瘤细胞发生氧化应激的影响图3结果表明，C87 0.25～2.5 μmol·L-1与HCT116和HeLa细胞作用6 h，可诱发细胞内ROS产生，且呈浓度依赖性(r2=0.760, P=0.045; r2=0.987, P=0.001)。图4结果表明，C87 2.5 μmol·L-1与HCT116和HeLa细胞作用0.5～6 h，ROS的产生呈时间依赖性 (r2=0.886, P=0.017; r2=0.994, P=0.000)。

2.3 抗氧化剂NAC对C87诱导ROS生成的影响图5结果表明，NAC预处理30 min后给予C87 2.5 μmol·L-1作用于HeLa和HCT116细胞6 h，C87可以明显增加细胞ROS的生成，NAC可以减少细胞ROS的生成；与C87单独给药组相比，NAC和C87联合作用可以明显减少ROS的生成(P<0.01)。采用2×2析因设计的方差分析对NAC和C87对细胞ROS产生的影响以及二者的交互作用进行分析，结果表明，与对照组比较，单独给予C87细胞内ROS的产生具有显著性差异(F=9183，P=0.000)；与对照组比较，单独给予NAC，细胞内ROS的产生具有显著性差异(F=9183，P=0.000)；并且2种药物存在明显的交互作用(F=1666，P=0.000); 组间两两比较提示，NAC 5 mmol·L-1能明显抑制C87诱导的ROS产生(P<0.01)。

2.4 抗氧化剂NAC对C87引起的细胞生长抑制的影响图6结果表明，联合给以不同浓度NAC 5和10 mmol·L-1及不同浓度C87 0.05, 0.1, 0.25, 0.5和1 μmol·L-1处理HCT116细胞24和48 h后，C87可浓度依赖性地抑制HCT116细胞的生长，24 h：r2=0.969, P=0.000; 48 h：r2=0.857, P=0.008。NAC 5和10 mmol·L-1单独作用不影响细胞生长，但可使C87的生长抑制曲线向右偏移，提示NAC可部分逆转C87对细胞生长的抑制作用。计算C87的GI50值，作用24 h，C87, NAC 5 mmol·L-1+C87和NAC 10 mmol·L-1+C87时C87的GI50分别为0.513，1.446和1.134 μmol·L-1。作用48 h，C87, NAC 5 mmol·L-1+C87和NAC 10 mmol·L-1+C87时C87的GI50分别为0.333，0.882和1.166 μmol·L-1。NAC 5 mmol·L-1+C87和NAC 10 mmol·L-1+C87条件下C87的GI50约为C87单用时GI50的2或3倍以上。

3 讨论

ETP类化合物是由2个氨基酸环合形成的含硫桥键的二酮哌嗪母核类化合物[10]。我们在前期筛选中发现，新的ETP类化合物C87在HeLa, HCT116, SMMC7721, A549, H460, H1993和MDA-MB-231等多种肿瘤细胞系上均具有非常显著的细胞生长抑制活性。本研究主要用HCT116, A549, SMMC7721和HeLa 4种细胞观察C87对细胞生长的抑制活性及机制。鉴于ETP类化合物的硫桥键可能是其主要的功能基团，在进入细胞后有可能参与细胞内的氧化还原循环，诱导细胞发生氧化应激[9]，因此，本研究主要对C87处理后细胞内ROS的产生进行测定，并观察抗氧化剂NAC对C87抑制肿瘤细胞生长的影响。本研究结果显示，化合物C87可时间和浓度依赖性地诱导肿瘤细胞内ROS产生，其中用2.5 μmol·L-1刺激6 h时可观察到ROS大量产生，产量达对照组的5～7倍。给予抗氧化剂NAC后能明显抑制C87引起的ROS产生，并且可以明显逆转C87对细胞生长的抑制作用，提示C87处理后产生的细胞内氧化应激与其对肿瘤细胞生长抑制作用密切相关。然而，从作用24和48 h的细胞存活率测定结果均可见，C87的细胞生长抑制效应并不能被NAC完全逆转。这一方面提示，除了诱导氧化应激导致细胞损伤外，C87可能还有其他的作用机制；另一方面，在体外实验中，NAC作为抗氧化剂，其给药浓度和作用时间的限制可能也是导致其只有部分拮抗作用的原因。ROS包括氧自由基、羟自由基和过氧化氢等多种自由基类型，参与细胞增殖、分化、衰老和凋亡等多种生理和病理过程。正常水平的ROS对许多氧化还原依赖性细胞信号转导过程是必需的；当细胞受到不同类型的外源性刺激时，过量产生的不同来源的ROS可引起细胞内氧化应激，从而导致细胞内许多分子发生化学修饰或活性改变，最终使细胞损伤或死亡[11]。C87主要诱导哪种类型的ROS产生及其引起细胞损伤的机制尚有待进一步研究。另有研究报道，ETP类化合物可以通过激活p53信号通路诱导细胞周期发生G2/M期阻断[12]，并可抑制酪氨酸激酶活性[13]，显示对新生血管的抑制作用[14]。作为一种新的ETP类化合物，C87是否也通过上述机制发挥抗肿瘤作用，以及其是否在动物体内仍具有有效的抗肿瘤活性非常值得进一步研究。本研究结果表明，ETP类化合物C87通过诱导细胞内氧化应激，可显著抑制多种肿瘤细胞的生长，但此类化合物最终发展成为新结构类型的抗肿瘤药物尚需进一步研究。总之，目前有关ETP类化合物的研究均表明该类化合物有较好的生物学活性，本研究对阐明其结构与功能关系、以及分子作用机制等均提供了重要的实验依据。

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(本文编辑: 齐春会)

Suppression of epipolythiodioxopiperazine compound C87on growth of tumor cells and its effect on productionof reactive oxygen species

GAO Yi-yang1,2, WEI Xiao-li2, YANG Xiao-wen2, REN Feng-xia2, ZHENG Jian-quan2,ZHENG Zhi-bing1,2, SU Rui-bin1,2

(1.PharmaceuticalCollege,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China; 2.StateKeyLaboratoryofToxicologyandMedicalCountermeasures,DepartmentofMilitaryToxicologyandBiochemicalPharmacology,InstituteofPharmacologyandToxicology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China)

OBJECTIVE To study the effect of epipolythiodioxopiperazine compound C87 on tumor cell proliferation and explore the potential mechanisms. METHODS Tumor cells were exposed to C87 0.05-1 μmol·L-1for 24, 48 and 72 h, cell viability was determined by sulforhodamine B (SRB) assay and the half growth inhibition (GI50) was calculated. After treatment with C87 0.1-2.5 μmol·L-1for 6 h, or C87 2.5 μmol·L-1for 0-6 h, the generation of reactive oxygen species (ROS) was measured using the compound 2′,7′-dichlorofluoresceindiacetate and flow cytometry analysis. After treatment with C87 2.5 μmol·L-1, either alone or with antioxidant N-acetylcysteine (NAC), for 6 h, the generation of ROS was measured by flow cytometry analysis. Tumor cells were exposed to C87 0.05-1 μmol·L-1, either alone or with NAC, for 24 and 48 h, while cell viability was determined by SRB assay. RESULTS The cell viability was significantly reduced following exposure to C87 0.05-1 μmol·L-1for 24, 48 and 72 h in a concentration-dependent manner in A549, HCT116, HeLa and SMMC7721 cells(P<0.05). At 72 h, the value ofr2was 0.946, 0.989, 0.973 and 0.984(P<0.05), respectively. The cell viability was significantly reduced following exposure to C87 1 μmol·L-1for 24-72 h in a time-dependent manner in A549, HCT116, HeLa and SMMC7721 cells(P<0.05). The value ofr2was 0.983, 0.956, 0.951 and 0.873(P<0.05), respectively. The generation of ROS was increased after exposure to C87 0.25-2.5 μmol·L-1in a concentration-dependent manner in HCT116 and HeLa cells for 6 h (r2=0.760,P=0.045;r2=0.987,P=0.001), and after exposure to C87 2.5 μmol·L-1in a time-dependent manner in HCT116 and HeLa cells for 0.5-6 h (r2=0.886,P=0.017;r2=0.994,P=0.000).The C87-induced ROS generation could be blocked by NAC in HCT116 and HeLa cells(P<0.05). The C87 induced cell death could be blocked by NAC 5 and 10 mmol·L-1, and the GI50value was 1.446 and 1.134 μmol·L-1for 24 h (the GI50value of C87 group was 0.513 μmol·L-1), and 0.882 and 1.166 μmol·L-1for 48 h (the GI50value of C87 group was 0.333 μmol·L-1). CONCLUSION The novel epipolythiodioxopiperazine derivative C87 exerts potent antitumor activityinvitro, possibly via triggering ROS production.Key words: epipolythiodioxopiperazine compound; C87; tumor cells, cultured; reactive oxygen species

WEI Xiao-li, E-mail: weixl@bmi.ac.cn; SU Rui-bin, E-mail: ruibinsu@126.com

国家科技重大专项(2012ZX09301003)；国家自然科学基金(30973563)

高艺洋(1988-)，女，硕士研究生，主要从事肿瘤分子药理学研究，E-mail: gaoyiyang000@163.com

魏晓莉, E-mail: weixl@bmi.ac.cn; 苏瑞斌，E-mail: ruibinsu@126.com

Foundation item: The project supported by National Science and Technology Major Projects of China (2012ZX09301003); and National Natural Science Foundation of China (30973563)

2014-12-15 接受日期: 2015-03-12)

R979.1

A

1000-3002(2015)02-0253-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.011

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