培哚普利对异丙肾上腺素致大鼠心肌肥厚中H2S／CSE合成途径的影响

鲁 艳，王爱玲，陈 森，郭 增，李 丽，王春苗，郭晓琳

培哚普利对异丙肾上腺素致大鼠心肌肥厚中H2S／CSE合成途径的影响

鲁 艳1，王爱玲1，陈 森2，郭 增3，李 丽1，王春苗1，郭晓琳1

摘要目的 研究在异丙肾上腺素（ISO）致大鼠心肌肥厚模型中，培哚普利对大鼠心肌组织硫化氢／胱硫醚-γ-裂解酶（H2S／CSE）合成途径的影响。方法 40只大鼠随机均分为模型组、培哚普利＋模型组、培哚普利对照组和空白对照组，采用皮下注射ISO制备心肌肥厚模型。检测大鼠心脏质量指数（HMI）和左心室质量指数（LVMI），心肌组织中H2S含量及其生成酶活性，心肌组织中CSE蛋白表达情况。结果与空白对照组比较，模型组大鼠HMI、LVMI升高（P＜0.01），心肌肥厚明显，H2S含量及其生成酶活性减少（P＜0.01），CSE表达下降（P＜0.05），培哚普利对照组大鼠心肌H2S含量及其生成酶活性升高（P＜0.01），CSE表达增加（P ＜0.05）。与模型组比较，培哚普利＋模型组大鼠HMI、LVMI下降（P＜0.01），心肌中H2S含量及其生成酶活性升高（P＜0.01），CSE表达增加（P＜0.05）。与培哚普利对照组比较，培哚普利＋模型组大鼠HMI、LVMI升高（P＜0.01），心肌中H2S含量及其生成酶活性下降（P＜0.01），CSE表达下降（P＜0.05）。结论 培哚普利能够提高大鼠心肌中H2S含量及其生成酶活性，可能与其能够提高CSE表达，影响H2S／CSE合成途径相关，其中在治疗ISO所致大鼠心肌肥厚模型中作用更加明显。

关键词心肌肥厚；硫化氢；培哚普利；异丙肾上腺素

2015-01-13接收

作者单位：1安徽医科大学第一附属医院心血管内科，合肥 230022

2蚌埠医学院第一附属医院老年病科，蚌埠 233004

3安徽医科大学附属省立第二医院重症监护室，合肥230064

心肌肥厚是引起心血管疾病发生率和死亡率显著升高的独立危险因素，与高血压性心脏病、心律失常、心源性猝死等关系密切。血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）常用于治疗心肌肥厚相关疾病，与其具有明确的降血压、改善心室重构等作用有关［1］。ACEI可影响正常大鼠［2］及自发性高血压［3］或腹主动脉缩窄术［4］引起的大鼠心肌肥厚模型心肌组织中硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）的含量。H2S作为内源性气体信号分子，具有舒张血管降低血压、抑制血管平滑肌细胞增殖，改善心肌重构等生物学效应［5］，在哺乳动物心肌组织中H2S主要通过胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）［6］产生。心肌组织中H2S含量的改变与许多心血管疾病的发生和治疗过程关系密切［5］。该研究采用异丙肾上腺素（isoprenaline，ISO）制备大鼠心肌肥厚模型［7］，通过ACEI之一的培哚普利作用于模型，比较心肌组织中H2S含量及其合成酶活性和主要生成酶CSE表达等指标，探讨培哚普利在大鼠心肌肥厚模型中对H2S／CSE合成途径的影响。

1　材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠40只，清洁级，180 ±20 g，购自安徽省实验动物中心，实验前常规适应性饲养1周，观察无异常者入组，实验中对动物的处置符合动物伦理学要求。

1.1.2 主要药物和试剂 ISO购自上海禾丰制药有限公司，批号：20130725；培哚普利购自天津施维雅制药有限公司，批号：2004789；NaHS、磷酸吡哆醛、硝酸纤维膜（NC膜）购自美国Sigma公司；N，N-二甲基-对苯二胺盐酸盐购自上海生工生物有限公

司；BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒购自上海碧云天生物有限公司；GAPDH、二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL购自美国Thermo Fisher Scientific公司；抗CSE抗体购自美国Proteintech公司；倒置显微镜型号为奥林巴斯CKX41IX53，由安徽省干细胞库提供。

1.2 方法

1.2.1 制备大鼠心肌肥厚模型 40只大鼠随机均分为培哚普利对照组、空白对照组、模型组和培哚普利＋模型组。根据文献［7］及预实验结果，模型组及培哚普利＋模型组予以背部多点皮下注射2.5 mg／（kg·d）ISO，余下两组予以等量生理盐水皮下注射。7 d后，培哚普利对照组、培哚普利＋模型组予以4 mg／（kg·d）培哚普利灌胃治疗，模型组及空白对照组以同等量生理盐水灌胃。共饲养4周，末次给药后，禁食水12 h，再观察各组指标。

1.2.2 心肌肥厚指数测定 大鼠称取体重（body weight，BW），按3 ml／kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉后固定于鼠板上。大鼠胸部备皮，打开胸腔分离心脏，快速剪去周边组织，预冷的生理盐水充分将心脏冲洗干净，滤纸吸干后称取心脏质量（heart mass，HM），除去右心室（保留室间隔），称取左心室质量（left ventricular mass，LVM），计算心脏质量指数（heart mass index，HMI）和左心室质量指数（left ventricular mass index，LVMI）。HMI＝HM／BW（mg／g），LVMI＝LVM／BW（mg／g），以LVMI反映心肌肥厚程度。

1.2.3 心肌组织学检查 将分离出的左心室沿长轴横切，均分3部分，上、下两部分立即置于液氮中，统一收集后放入-80℃冰箱保存，待用；取中间部分，快速置于4%多聚甲醛固定，用于常规包埋石蜡，连续切片；作HE染色，镜下观察心肌组织形态学改变。

1.2.4 心肌组织H2S含量检测 用系列浓度的NaHS溶液绘制标准曲线。取部分上述大鼠左心室心肌组织，洗净、吸干、精密称量质量，用1 mmol／L PBS通过玻璃匀浆器制备10%（W／V）心肌组织匀浆，4℃、4 000 r／min离心10 min，取上清液。BCA蛋白定量后取0.1 ml匀浆转移至试管中，加入0.5 ml 1%醋酸锌，迅速混匀后，再依次加入20 mmol／L N，N-二甲基-对苯二胺硫酸盐（含7.2 mol／L盐酸）0.5 ml、30 mmol／L三氯化铁（含1.2 mol／L盐酸）0.4 ml，静置20 min，充分显色后加入10%三氯乙酸1 ml，蒸馏水2.5 ml，6 000 r／min离心5 min，取上清液，在670 nm处通过紫外分光光度仪读取吸光度，根据已制作NaHS溶液制备的标准曲线计算心肌组织中H2S含量。

1.2.5 心肌组织CSE酶活性检测 取制备的10%心肌组织匀浆，在250 ml锥形瓶中进行实验，反应液1 ml，含磷酸钾缓冲液（pH 7.4，100 mmol／L）、L-半胱氨酸（10 mmol／L）、5-磷酸吡哆醛（2 mmol／L）0.9 ml，10%组织匀浆0.1 ml。中央室中加入1%醋酸锌0.5 ml。折叠放入2.0 cm×2.5 cm滤纸加大吸收面积，锥形瓶在风口前用氮气充盈30 s，转移到37℃恒温摇床中反应90 min后注入50%三氯乙酸0.5 ml，继续孵育60 min后终止反应。再在中央室液体加入3.6 ml蒸馏水，20 mmol／L N，N-二甲基-对苯二胺硫酸盐（含7.2 mol／L盐酸）0.5 ml、30 mmol／L三氯化铁（含1.2 mol／L盐酸）0.4 ml，混匀，室温静置20 min。在波长670 nm处使用紫外分光光度仪读取吸光度，根据已制作的NaHS标准曲线计算心肌组织中H2S生成率，即得出组织中CSE活性。

1.2.6 Western blot法检测CSE表达 将上述部分大鼠左心室心肌组织剪碎，每20 mg加入0.3 ml RIPA裂解液（含1 mmol／L PMSF），玻璃匀浆器制备组织匀浆，4℃、12 000 r／min离心15 min，取上清液；BCA蛋白定量后加入上样缓冲液，100℃水浴变性10 min，12%SDS-PAGE电泳，恒流200 mA，2 h，转至NC膜；室温封闭2 h，加一抗CSE（1∶500）或GAPDH（1∶800）4℃过夜后，辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1∶15 000）室温孵育2 h，ECL涂于NC膜上，曝光并采集图像。Image J软件分析蛋白条带，以GAPDH的表达量作为参照。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2　结果

2.1 各组大鼠HMI、LVMI比较 各组HMI、LVMI差异有统计学意义（F＝16.31、17.82）。与空白对照组比较，模型组和培哚普利＋模型组HMI、LVMI均升高（P＜0.01），培哚普利对照组HMI、LVMI差异无统计学意义；与模型组比较，培哚普利＋模型组HMI、LVMI降低（P＜0.01），见表1。

2.2 镜下观察大鼠心肌形态学病理变化 空白对照组和培哚普利对照组心肌细胞形态正常，心肌纤维排列整齐；模型组心肌细胞可见肥大，心肌细胞间

质增宽，甚至部分心肌纤维出现断裂变性及少量心肌细胞坏死；与模型组比较，培哚普利＋模型组心肌肥厚明显改善。见图1。

表1　各组大鼠HMI、LVMI比较（±s）

表1　各组大鼠HMI、LVMI比较（±s）

与空白对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：＃＃P＜0.01

组别　　存活例数（n）　HMI（mg／g）　LVMI（mg／g）培哚普利对照10　2.34±0.15　1.95±0.13空白对照　10　2.37±0.12　1.93±0.12模型　7　3.09±0.09**　2.45±0.12**培哚普利＋模型　8　2.78±0.12**＃＃2.19±0.10**＃＃

2.3 培哚普利对大鼠H2S及其生成酶活性的影响

各组H2S、CSE差异有统计学意义（F＝51.42、202.17）：与空白对照组比较，模型组H2S含量及其生成酶活性明显下降（P＜0.01），培哚普利对照组H2S含量及其生成酶活性明显上升（P＜0.01）；与培哚普利＋模型组比较，模型组H2S含量及其生成酶活性明显下降（P＜0.05），培哚普利对照组H2S含量及其生成酶活性明显上升（P＜0.05），见表2。

表2　各组心肌组织中内源性H2S含量及其生成酶活性（±s）

表2　各组心肌组织中内源性H2S含量及其生成酶活性（±s）

与空白对照组比较：**P＜0.01；与培哚普利＋模型组比较：＃P ＜0.05

组别　　存活例数（n）　H2S（μmol／g）　CSE ［nmol／（min·mg ）］空白对照10　21.5±2.04　2.81±0.15培哚普利对照　10　24.5±1.78**＃　3.21±0.13**＃模型　7　14.3±1.57**＃　1.56±0.17**＃培哚普利＋模型8　17.8±1.85　1.91±0.18

2.4 培哚普利对CSE表达的影响 Western blot法检测大鼠心肌CSE表达情况：各组CSE相对表达量差异有统计学意义（F＝255.67）：与空白对照组比较，模型组CSE表达下降（P＜0.05），培哚普利对照组CSE表达升高（P＜0.05）；与培哚普利＋模型组比较，培哚普利对照组CSE表达升高（P＜0.05），模型组CSE表达下降（P＜0.05），该结果与上述心肌组织中H2S含量及其生成酶活性变化趋于一致。见图2。比较培哚普利＋模型组与模型组中CSE的表达比值同培哚普利对照组与空白对照组比值表明，培哚普利对心肌肥厚大鼠中CSE表达高于正常大鼠（P＜0.05）。

3　讨论

皮下注射β受体激动剂ISO可诱导大鼠心肌肥厚，与其能够激活肾上腺素受体、增加心肌细胞合成代谢和钙离子超负荷相关［8］。本研究依此建立模型，并根据HMI、LVMI和病理学改变等确认大鼠心肌肥厚造模成功。H2S作为一类重要气体信号分子，在哺乳动物体内主要通过胱硫醚-β-合成酶、CSE 和3-巯基丙酮酸硫基转移酶合成代谢，其中心血管组织以CSE［9］为主。H2S对心血管系统具有重要保护作用［10-11］，内源性H2S能够通过防止心肌细胞凋亡［12］及相关金属蛋白酶减少心肌纤维化［5］等途径改善大鼠心肌肥厚。在自发性高血压大鼠［3］、腹主动脉缩窄术［4］等引起的心肌肥厚模型中，心肌组织H2S含量均下降，另有发现H2S／CSE合成途径在急性心肌缺血模型中也有重要作用［13］，提示H2S／CSE合成途径改变与心肌肥厚等心血管疾病发生关系密切。培哚普利作为ACEI主要通过肾素血管紧张素系统治疗心肌肥厚［14］，近来研究［15］显示ACEI在治疗高血压大鼠存在H2S／CSE合成途径的改变。因此研究心肌肥厚模型中培哚普利对心肌组织

H2S／CSE合成途径的影响，在ACEI治疗心肌肥厚的机制和心肌肥厚相关疾病的发生等方面均有重要价值。

本研究显示在ISO引起大鼠心肌肥厚模型中，心肌组织中H2S含量及其生成酶活性下降，这与上述研究［3-4］结果一致，CSE表达下降，提示在心肌肥厚形成过程中，内源性H2S合成减少。在培哚普利＋模型组中，CSE表达升高，表明培哚普利在治疗心肌肥厚过程中，通过提高CSE表达影响H2S／CSE合成途径，进而提高大鼠心肌中H2S含量，使大鼠HMI、LVMI下降，心肌肥厚明显改善。另有研究［2］显示雷米普利能够提高正常大鼠心肌中H2S含量，为比较培哚普利对正常和心肌肥厚模型大鼠心肌组织H2S／CSE合成途径的影响，本研究设置了培哚普利对照组。通过观察与正常和心肌肥厚模型大鼠心肌组织H2S含量及其生成酶活性和CSE表达变化，结果显示培哚普利对照组中H2S含量及其生成酶活性高于空白对照组，与相关研究［2］结果一致，而CSE表达高于空白对照组，提示培哚普利在正常大鼠心肌中也能够通过提高CSE表达影响H2S／CSE合成途径。进一步比较CSE在培哚普利组与空白对照同培哚普利＋模型组与模型组中表达，表明培哚普利对H2S／CSE合成途径的影响在ISO致大鼠心肌肥厚模型中高于正常大鼠。

综上所述，培哚普利能够影响大鼠心肌组织H2S／CSE合成途径，提高内源性H2S含量及其生成酶活性，改善大鼠心功能，与其能够提高CSE表达有关，并且培哚普利对CSE表达的影响，在ISO诱导大鼠心肌肥厚模型中强于正常大鼠。

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Perindopril affects the H2S／CSE pathway in ISO-induced cardiac hypertrophy

Lu Yan1，Wang Ailing1，Chen Sen2，et al
（1Dept of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Geriatrics，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233004）

AbstractObjective To investigate how perindopril affects myocardial hydrogen sulfide／cystathionine-γ-lyase

（H2S／CSE）pathway in the model of isoprenaline（ISO）-induced cardiac hypertrophy rats.Methods 40 rats were randomly divided into a disease control group，a disease treated with perindopril group，a perindopril control group and a normal control group.Cardiac hypertrophy model was established by a subcutaneous injection of ISO.Heart mass index（HMI），left ventricular mass index（LVMI），the contents of H2S，the activity of H2S synthesizing enzymes and the expression of CSE were calculated.Results Compared with the normal control group，HMI and LVMI increased（P＜0.01），myocardial tissue thickened obviously，the contents of H2S and the activity of H2S synthesizing enzymes decreased（P＜0.01）and the expression of CSE also decreased（P＜0.05）in the disease control group.However，the contents of H2S and the activity of H2S synthesizing enzymes increased（P＜0.01）and the expression of CSE increased（P＜0.05）in the disease treated with perindopril group.Compared with the disease control group，HMI and LVMI decreased（P＜0.01），the contents of H2S and the activity of H2S synthesizing enzymes increased（P＜0.01）and the expression of CSE also increased（P＜0.05）in the disease treated with perindopril group.Compared with the perindorpril control group，HMI and LVMI increased（P＜0.01），the contents of H2S and the activity of H2S synthesizing enzymes decreased（P＜0.01）and the expression of CSE also decreased（P＜0.05）in the disease treated with perindopril group.Conclusion Perindopril can improve the contents of H2S and the activity of H2S synthesizing enzymes in myocardial tissue.It may be related to influence H2S ／CSE pathway via enhancing the expression of CSE which affects more in ISO-induced cardiac hypertrophy rats.

Key wordscardiac hypertrophy；H2S；perindopril；isoprenaline

作者简介：鲁 艳，男，硕士研究生；王爱玲，女，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：wal＠ah.edu.cn

基金项目：安徽省自然科学基金（编号：11040606M155）；安徽省教育厅高等教育振兴计划项目（编号：2013zdjy066）；安徽省教育厅高等学校教学研究委托重大项目（编号：2012jyzd09w）

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）05-0621-05

中图分类号R 542.2