化学合成microRNA-21 inhibitors对大鼠心肌成纤维细胞活化增殖的影响

张 猛，陶 辉，陈泽文，张家贵，宣海洋，占红英，石开虎

化学合成microRNA-21 inhibitors对大鼠心肌成纤维细胞活化增殖的影响

张 猛1，2，陶 辉1，2，陈泽文1，2，张家贵1，2，宣海洋1，2，占红英1，2，石开虎1，2

摘要目的 探究microRNA-21 inhibitors对大鼠心肌成纤维细胞活化增殖的影响。方法 应用LipofectamineTM2000 Reagent向大鼠心肌成纤维细胞瞬时转染microRNA-21 inhibitors 24、48 h后，实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测microRNA-21、I型胶原前胶原A1（Col1A1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平；Western blot法检测Col1A1 和α-SMA的表达水平；MTT法检测microRNA-21 inhibitors对心肌成纤维细胞活化增殖的影响。结果 转染microRNA-21 inhibitors的心肌成纤维细胞中，microRNA-21表达下调，Col1A1和α-SMA的表达下降；转染microRNA-21 inhibitors的心肌成纤维细胞增殖活性明显减弱。结论 microRNA-21 inhibitors可明显抑制心肌成纤维细胞增殖活性，提示microRNA-21是心肌成纤维细胞活化增殖的潜在靶向分子，有利于为干预和预防心肌纤维化的发生发展提供新思路。

关键词microRNA-21；心肌成纤维细胞；Col1A1；α-平滑肌肌动蛋白

2015-02-02接收

作者单位：1安徽医科大学第二附属医院心胸外科，合肥 230601

2安徽医科大学心血管病研究中心，合肥 230601

心肌纤维化是指心肌细胞外基质中胶原纤维过量积聚、胶原含量显著升高或胶原成分发生改变的病理过程，是心肌重构的一个重要特征［1-2］。心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）是心肌间质的主要构成细胞，其增殖、活化及表型转换为肌成纤维细胞并合成分泌大量胶原纤维蛋白。CFs的活化增殖是心肌纤维化的关键环节。microRNA是一类内源性、非编码、单链RNA，参与心血管系统的生理及多种病理过程。microRNA-21在心脏中表达丰富，而且其生理功能与心肌纤维化密切相关。microRNA-21在心肌纤维化的发生发展中起重要的调节作用［3］。尽管国内外学者对心肌纤维化和microRNA-21进行了大量研究，但CFs中microRNA-21的确切作用机制尚不完全清楚。该实验以体外培养的CFs为研究对象，通过观察microRNA-21 inhibitors转染后CFs的增殖影响、I型胶原前胶原A1（collagen type I alpha 1，Col1A1）及CFs表型转换为肌成纤维细胞的标志性蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表达变化，为心肌纤维化、心脏重构提供新的参考依据。

1　材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD乳鼠30只，出生1～3 d，8～9 g，清洁级，购于安徽医科大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、胰蛋白酶、MTT相关试剂（Sigma公司，美国）；胎牛血清（Gibco公司，英国）；LipofectamineTM2000 Reagent、TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国）；microRNA-21 inhibitors、EzOmics miRNA qPCR Detection Primer试剂盒、EzOmics One-Step qPCR试剂盒（Biomic公司，美国）；ThermoScript RT-PCR试剂盒（Fermentas公司，美国）；Western blot法相关一抗（Bioworld Technology公司，美国）、相关二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，中国）；转化生长因子-β（TGF-β）（Peprotech，美国）。

1.1.3 主要仪器 NAPCO-6100型细胞培养箱（SHELLAB公司，美国）；SW-CJ-IF型超净工作台（苏州泰安空气技术有限公司，中国）；Sigma3-16K高速离心机（Sigma公司，美国）；7800型PCR反应扩增仪（ABI公司，美国）；Western blot法相关设备（Biorad公司，美国）；MK3酶标仪（雷勃公司，荷兰）。

1.2 方法

1.2.1 CFs的提取与培养 将SD乳鼠浸泡于75°酒精消毒并处死，在无菌操作台上剪取心尖组织，剪碎并用1.25%胰蛋白酶消化分离细胞，所得全部细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养60～90 min，差速贴壁法除去心肌细胞，剩下的细胞即为CFs。继续培养

细胞至汇合状态，采用0.25%胰蛋白酶消化传代，取2～4代细胞用于实验，在倒置显微镜下观察到可被免疫组化纤维黏连蛋白染色变为阳性者即鉴定为CFs。

1.2.2 实验分组 实验组：瞬时转染microRNA-21 inhibitors后的CFs；阴性对照组：瞬时转染microRNA-21 inhibitors阴性对照后的CFs；空白对照组：以等量的生理盐水代替microRNA-21 inhibitors，瞬时转染CFs。

1.2.3 瞬时转染microRNA-21 inhibitors 取对数生长期CFs进行转染。转染前1 d，将各组CFs细胞计数后，接种于24孔板，用无血清不含抗生素的DMEM培养液稀释待转染。成熟引物microRNA-21 inhibitors及其阴性对照由Biomic生物技术公司设计并合成。miRNA-21 inhibitor的引物序列：5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′。将miRNA-21 inhibitors及其阴性对照与脂质体LipofectamineTM2000 Reagent混匀，室温静置20 min后，加入相应各孔细胞中，37℃、5%CO2保温箱孵育4～6 h，更换含血清DMEM并用浓度为10 ng／ml的生长刺激因子TGF-β刺激细胞生长，24、48 h提取转染后细胞的总RNA。

1.2.4 总RNA提取和一步法qRT-PCR检测microRNA-21 检测转染后各组CFs中的microRNA-21含量，用ABI RT-PCR系统进行qRT-PCR检测。采用TRIzol并根据操作手册一步法抽提细胞总RNA，紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，通过计算吸光度（absorbance，A）A260／A280的比值了解其纯度，选取比值在1.8～2.0的RNA样品进行试验。采用EzOmics miRNA qPCR Detection Primer试剂盒与EzOmics One-Step qPCR试剂盒并参照操作手册检测microRNA-21。反应条件：42℃30 min、95 ℃10 min，接着95℃20 s、62℃30 s、72℃30 s共40个循环的扩增阶段条件；95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s的溶解曲线阶段条件。以U6作为内参，用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达水平。

1.2.5 定量RT-PCR检测Col1A1和α-SMA mRNA表达 各组总RNA用ThermoScript RT-PCR试剂盒并参照操作手册逆转录合成cDNA，然后进行qRTPCR检测。从GenBank中查找引物序列并设计合成相应引物。α-SMA引物序列：F：5′-TGGCCACTGCTGCTTCCTCTTCTT-3′，R：5′-GGGGCCAGCTTCGTCATACTCCT-3′；Col1A1引物序列：F：5′-TAACTTCTGGACTATTTGCGGACTTTTTGG-3′，R：5′-GTCCAGCCCTCATCCTGGCC-3′；β-actin引物序列：F：5′-ACGGTCAGGTCATCACTATC-3′，R：5′-ACTGTGTTGGCATAGAGGTC-3′。反应条件：50℃2 min、95℃10 min，接着95℃20 s、60℃30 s、72℃30 s 共40个循环的扩增阶段条件；95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s的溶解曲线阶段条件。以β-actin作为内参，用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达水平。

1.2.6 Western blot法检测Col1A1和α-SMA蛋白表达 将提取的各组细胞蛋白定量，然后通过SDSPAGE电泳分离，转移至PVDF膜上，转膜后封闭2 h，加入Col1A1、α-SMA和β-actin一抗孵育过夜，然后加入Col1A1、α-SMA和β-actin二抗孵育1 h，化学发光法显示蛋白条带，胶片显影、定影。成像结果采用Quantity One V 4.6软件分析，测定主带的吸光度值以计算Col1A1、α-SMA蛋白表达水平。

1.2.7 MTT比色法检测细胞增殖 将处于对数生长期的各组CFs胰蛋白酶消化后，用完全培养基重悬形成细胞悬液。用血球计数板进行细胞计数。调整细胞密度为1 500个／孔，铺于96孔板中，每组5个复孔，每孔100 μl，共5张96孔板，连续监测5 d，铺板过程中要确保每孔加入细胞数一致。置于37℃、5%CO2培养箱培养。从铺板后第2天开始，培养终止前4 h每孔加入10 μl 5 g／L的MTT，无需换液，4 h后，吸弃培养液，每孔加入100 μl DMSO终止反应，振荡器震荡5～10 min使结晶充分溶解，酶标仪490 nm处测定A值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行分析，数据以±s表示，单变量两组资料间的比较采用t检验。所有实验数据分析至少重复3次。

2　结果

2.1 瞬时转染microRNA-21 inhibitors对microRNA-21表达的影响 瞬时转染CFs microRNA-21 inhibitors 48 h后，实验组microRNA-21表达明显低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义（t＝14.384，P＜0.01；t＝15.290，P＜0.01）。见图1。

2.2 瞬时转染microRNA-21 inhibitors对Col1A1 和α-SMA mRNA表达的影响 瞬时转染CFs microRNA-21 inhibitors 48 h后，实验组Col1A1和α-SMA mRNA表达明显低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义（Col1A1：实验组vs空白对照组：t＝13.694，P＜0.01；实验组vs阴性对照组：t＝14.571，P＜0.01；α-SMA：实验组vs空白对照组：t＝5.869，P＜0.01；实验组vs阴性对照组：t＝7.286，P

＜0.01）。见图2。

2.3 瞬时转染microRNA-21 inhibitors对Col1A1 和α-SMA蛋白表达的影响 瞬时转染CFs microRNA-21 inhibitors 48 h后，实验组Col1A1和α-SMA蛋白表达明显低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义（Col1A1：实验组vs空白对照组：t＝6.274，P＜0.01；实验组vs阴性对照组：t＝7.893，P ＜0.01；α-SMA：实验组vs空白对照组：t＝5.869，P ＜0.01；实验组vs阴性对照组：t＝14.131，P＜0.01）。见图3。

2.4 MTT法检测转染后CFs的细胞活力 MTT法实验结果显示，瞬时转染CFs microRNA-21 inhibitors 24、48 h后，实验组细胞活力明显低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义（Col1A1：实验组vs空白对照组：t＝3.764，P＜0.01；实验组vs阴性对照组：t＝5.645，P＜0.01；α-SMA：实验组vs空白对照组：t＝3.811，P＜0.01；实验组vs阴性对照组：t＝4.503，P＜0.01）。见图4。

3　讨论

CFs是心脏组织中数目最多的细胞，遍布于心肌组织，包绕心肌细胞并连接细胞间质，是心肌纤维化的主要效应细胞，其过度活化增殖，可分泌大量的胶原纤维，在心肌纤维化的发生发展过程中发挥关键性作用［4-5］。CFs是合成和分泌心肌细胞外基质的主要细胞，受刺激后活化，发生表型和功能的改变，转换为表达α-SMA的肌成纤维细胞，且过度增殖并积聚大量的细胞外基质，如Col1A1等［6-7］。因此，心肌纤维化主要通过CFs活化增殖并促进

Col1A1和α-SMA等的过度表达，使细胞外间质胶原纤维沉积、胶原含量显著上升，导致纤维化形成。

文献［8-9］报道，microRNA在心脏结构重构进程中，尤其是在心肌纤维化的发病过程中发挥重要作用。有许多microRNA可能发挥调控心肌纤维化的作用，已经证实的有microRNA-21、microRNA-29、microRNA-133、microRNA-30和microRNA-590等［10］。microRNA-21在心肌纤维化中有关键作用，与心肌纤维化联系密切。Thum et al［11-12］发现，microRNA-21在心肌纤维化中表达升高，上调microRNA-21可以刺激EPK-MAP信号传导通路，诱导成纤维细胞的增殖和心肌纤维化。Roy et al［13］证明，在大鼠心肌缺血再灌注模型中，microRNA-21在心肌纤维化和结构重构中起关键作用。microRNA-21之所以能够引起心肌纤维化是因为它与CFs有相关关系。研究［3］表明microRNA-21可以抑制CFs的凋亡，引起心肌肥大和心肌纤维化的发生。microRNA-21 inhibitors是microRNA-21的抑制剂，其在CFs活化增殖过程中的具体作用机制尚不完全清楚。本研究用microRNA-21 inhibitors转染体外培养的新生乳鼠CFs，检测转染后CFs的增殖变化以及Col1A1和α-SMA的表达水平。结果表明microRNA-21 inhibitors可明显抑制CFs的增殖活性，降低Col1A1和α-SMA的表达水平。

综上所述，microRNA-21 inhibitors转染CFs后，microRNA-21表达下降，而CFs中microRNA-21的低表达可以抑制其活化增殖，抑制心肌纤维化的发生发展，表明microRNA-21是CFs活化增殖的潜在靶向分子，可以为干预和预防心肌纤维化提供新思路。

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The effect of microRNA-21 inhibitors on proliferation and activation of cardiac fibroblasts in rats

Zhang Meng1，2，Tao Hui1，2，Chen Zewen1，2，et al
（1Dept of Cardio-Thoracic Surgery，The Second Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601；2Dept of Cardiovascular Disease Research Center，Anhui Medical University，Hefei 230601）

AbstractObjective To investigate the effect of microRNA-21 inhibitors on proliferation and activation of cardiac fibroblasts in rats.Methods LipofectamineTM2000 Reagent was used to transfected cardiac fibroblasts with microRNA-21 inhibitors.After 24，48 h，qRT-PCR was applied to assess the expressions of microRNA-21 and mRNA

of Col1A1 and α-SMA.The protein expression levels of Col1A1 and α-SMA were detected by Western blot.MTT assay was used to determine the proliferation influence of the transfected cardiac fibroblasts.Results The cardiac fibroblasts transfected microRNA-21 inhibitors exhibited down-regulated microRNA-21 expression and attenuated Col1A1 and α-SMA mRNA expression.The cardiac fibroblasts proliferation activity decreased significantly after transfected microRNA-21 inhibitors.Conclusion MicroRNA-21 inhibitors can suppress the proliferation activity of cardiac fibroblasts significantly，implicating microRNA-21 as a potential target for cardiac fibroblasts activation and proliferation and pointing out that this result can provide a new idea for intervening and preventing the myocardial fibrosis occurrence and development.

Key wordsmicroRNA-21；cardiac fibroblasts；Col1A1；α-SMA；Western blot

作者简介：张 猛，男，硕士研究生；石开虎，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：shikaihu ＠gmail.com

基金项目：安徽省自然科学基金项目（编号：1308085MH117、1408085MH175）；安徽高校省级自然科学研究项目（编号：KJ2011A175、KJ2012Z164）

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）05-0577-05

中图分类号R 542.23