腺苷受体及其介导的cAMP-PKA信号通路在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤中的作用

赵 晗，丁利平，吕雄文，王 和，王 琪，杨 凤，杨 岩，张媛媛

腺苷受体及其介导的cAMP-PKA信号通路在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤中的作用

赵 晗，丁利平，吕雄文，王 和，王 琪，杨 凤，杨 岩，张媛媛

摘要目的 探讨腺苷受体及其介导的环磷酸腺苷-蛋白激酶A（cAMP-PKA）信号通路在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤中的作用。方法 将20只雄性昆明种小鼠随机分为空白对照组和模型组。模型组给予对乙酰氨基酚500 mg／kg，空白对照组给予等量的生理盐水，两组均为单次灌胃给药。24 h后处死小鼠，检测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆汁酸（TBA），HE染色观察肝脏病理变化；原位肝灌注法分离小鼠肝细胞；Real-Time qPCR法、Western blot法分别检测肝细胞腺苷A1受体（A1R）、A2A受体（A2AR）、A2B受体（A2BR）和A3受体（A3R）水平；ELISA法检测各组细胞cAMP含量；Western blot法检测各组细胞PKA、磷酸化-环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（p-CREB）的表达水平。结果 与空白对照组比较，模型组AST、ALT、ALP、TBA表达明显增加（P＜0.01）且肝组织损伤明显；与空白对照组比较，模型组腺苷A1R、A2AR的表达明显升高（P＜0.01），cAMP含量、PKA、p-CREB蛋白的表达水平也相应增加（P＜0.05）。结论 对乙酰氨基酚致药物性肝脏损伤可能与cAMP-PKA信号通路有关。

关键词对乙酰氨基酚；肝损伤；腺苷受体

2015-02-02接收

作者单位：安徽医科大学药学院，合肥 230032

对乙酰氨基酚，又名扑热息痛，是目前使用最广泛的解热镇痛药，但该药的过量使用会引起肝细胞毒性，导致肝脏损伤［1］。对乙酰氨基酚已在临床广泛使用，但如何合理抑制其肝毒性尚无良策。腺苷及腺苷受体（adenosine receptors，ARs）由于复杂的生物学作用和在多种疾病中的重要调节功能受到了越来越多的关注［2］。腺苷作为一种内源性嘌呤核苷，主要通过结合并激活与G蛋白耦联的ARs，对机体的许多系统及组织发挥着重要作用。ARs广泛存在于肝细胞［3］，在肝病的发病机制中发挥不可忽视的作用［4-5］，但其在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤机制中的作用尚未见报道。研究［5］表明，当肝细胞受到甲氨蝶呤等药物刺激时，腺苷释放量会增加，ARs通过介导环磷酸腺苷-蛋白激酶A（cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A，cAMPPKA）信号通路参与肝脏炎症的发生。另有研究［6］表明，腺苷增加导致肝细胞低氧、炎症、急性损伤，而过量的对乙酰氨基酚也造成肝细胞损伤［7-8］。由此推测，对乙酰氨基酚通过激活ARs而引起肝细胞损伤，cAMP-PKA信号通路也参与其中。该研究拟通过对乙酰氨基酚灌胃制作药物性肝损伤模型，探讨ARs及其介导的cAMP-PKA信号通路在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤中的作用。

1　材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 昆明种小鼠，雄性，普通级，40～60 g，购自安徽医科大学实验动物中心。普通饲料喂养，自由进食及饮水，自然光照环境中饲养1周后进行实验。

1.1.2 主要试剂 对乙酰氨基酚（上海阿拉丁试剂公司）；乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸［ethylene glycol（2-aminoethyl ether）tetraacetic acid，EGTA］（美国Sigma公司）；Ⅰ型胶原酶、DMEM、胎牛血清（美国Gibco公司）；胰酶（美国Hyclone公司）；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（美国Amresco公司）；小鼠腺苷A1R、A2AR抗体（北京博奥森公司）；环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element bonding protein，CREB）、p-CREB抗体（北京安博公司）；β-actin、小鼠腺苷A2BR、A3R抗体（美国Santa Cruz公司）；TRIzol Reagent（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒、PCR试剂盒（美国Fermentas公司）；ECL化学发光试剂盒（美国Thermo公司）；cAMP ELISA检测试剂盒（美国R＆D公司）。

1.2 方法

1.2.1 对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型的建立

参考文献将20只雄性昆明种小鼠随机分为空白对照组、模型组，［9］方法，分别给予0.9%的氯化钠注射液500 mg／kg、对乙酰氨基酚500 mg／kg（生理盐

水配制），两组均为单次灌胃给药。24 h后眼眶取血并剖腹取肝，留取标本观察肝脏生化指标和组织病理学改变。

1.2.2 肝脏生化指标的检测 取血后，3 000 r／min离心10 min得血清，用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、总胆汁酸（total bile acid，TBA）水平。

1.2.3 肝脏组织病理学检查 收集各组的肝脏组织，分别取肝左叶组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，HE染色后，光镜下观察肝脏病变情况。肝细胞炎症活动度计分参考Knodell et al［10］计分标准，将小叶内变性、坏死和汇管区炎症分别计为0～4分，两者之和为每张切片的炎症活动度计分。

1.2.4 肝细胞的分离、培养和鉴定 将小鼠用10%水合氯醛（3 ml／kg）麻醉，用70%的酒精消毒小鼠腹部皮肤后打开小鼠腹腔，将内脏拨到右边，使门静脉暴露。在门静脉处放置外科缝合线并用静脉注射器插入门静脉。用缝合线将静脉注射器插管处固定并剪断下腔静脉。用在37℃水浴中预热过的0.5 mmol／L EGTA溶液灌注肝脏5 min，流速为5 ml／min，接着用预热过的0.075%Ⅰ型胶原酶液灌注5 min。分离肝脏并将其放置在60 mm×15 mm的无菌培养皿中用解剖剪刀切割肝脏，并加DHanks液到组织培养皿中。用移液器吸取肝组织液到50 ml无菌的锥形管中并确保溶液到35 ml标记处，并加入5 ml 0.075%Ⅰ型胶原酶液。将管子放到振荡器中室温下摇动15 min。通过70 μm的细胞过滤器过滤细胞并转移至干净的50 ml锥形管中，室温下532 r／min离心5 min，弃上清液，将细胞沉淀重新悬浮于50 ml D-Hanks液中并在室温下再次离心，532 r／min离心5 min。弃上清液，在含20%胎牛血清的DMEM中混匀并接种。5%CO2、37℃恒温培养48 h，换液除去未贴壁细胞，由此纯化肝细胞，以后每隔24 h换液一次。肝细胞贴壁生长后，可观察到细胞呈岛状连接，细胞核较大且有双核或多核细胞出现。

1.2.5 肝细胞中ARs的表达

1.2.5.1 Real-Time qPCR法检测各组细胞中腺苷A1R、A2AR、A2BR、A3R表达水平 用TRIzol Regent试剂，按说明书方法提取各组细胞总RNA，具体操作参照试剂盒说明。以β-actin作为内参，上游引物：5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′，下游引物：5′-CCACAGGATTCCATACCCAA-3′；A1R上游引物：5′-TGGTGATTTGGGCTGTGAAGGT-3′，下游引物：5′-CAGGTGTGGAAGTAGGTCTGTGG-3′；A2AR上游引物：5′-CTGGGTGCTTGTGTGCTG-3′，下游引物：5′-GATGGTGATGGCGAATGGGAT-3′；A2BR上游引物：5′-GCGTCCCGCTCAGGTATAAAG-3′；下游引物：5′-CACCCCAGGAACGGAGTCAAT-3′；A3R上游引物：5′-GTTTCTGGTTCTCTTCTTGTTTGCG-3′，下游引物：5′-GGTTCATCATGGAGTTCGCGT-3′。

1.2.5.2 Western blot法检测肝细胞中的A1R、A2AR、A2BR、A3R、PKA、p-CREB蛋白的表达水平

各组细胞加入药物培养后，弃去培养瓶内培养液，用4℃的PBS润洗3次；每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，冰上裂解30 min；4℃、12 000 r／min离心30 min，取上清液与蛋白上样缓冲液混合，100℃加热10 min。每孔上样20 μl总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V）。电泳结束后用湿转仪将蛋白转移到PVDF膜上。膜在室温下用含50 g／L脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭3 h，用TBST清洗3次（每次15 min）后加入相应的一抗中，4℃过夜。再分别加入与一抗相匹配的二抗室温放置1 h，ECL发光试剂盒显影，以β-actin为内参，分别以相应蛋白与β-actin光密度比值表示该蛋白相对表达水平。

1.2.6 ELISA法检测肝细胞cAMP含量 收集细胞上清液，3 000 r／min离心10 min。按试剂盒说明书进行操作，绘制标准曲线，依次得出各组cAMP的含量。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行One-Way ANOVA分析，数据均为3次独立实验结果，以±s表示。组间比较采用S-N-K检验，等级资料采用秩和检验。

2　结果

2.1 各组小鼠肝功能相关检测结果 与空白对照组比较，模型组小鼠血清ALT、AST、ALP、TBA升高，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

2.2 各组小鼠肝脏组织病理学检查结果 空白对照组肝小叶结构正常，无肿胀、脂肪变性、坏死，肝小叶及汇管区无炎细胞浸润。与空白对照组相比，模型组肝小叶结构紊乱，小叶区、汇管区均出现炎性细胞浸润，细胞索排列紊乱，界限模糊不清，表明模型建立成功。见图1。空白对照组10只小鼠中，小叶内变性、坏死0分9例，1分1例，汇管区炎症0分8例，1分2例；模型组8只（死亡2只未计入）小鼠中，小叶内变性、坏死0分1例，1分1例，3分3例，4分3例，汇管区炎症0分1例，1分4例，3分3例。与空白对照组相比，模型组小鼠肝脏炎症活动度计分增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1　对乙酰氨基酚对小鼠血清中ALT、AST、ALP、TBA的影响（n＝10，±s）

与空白对照组比较：**P＜0.01

组别　　剂量（mg／kg）　ALT（U／L）　AST（U／L）　ALP（U／L）　TBA（μmol／L）空白对照　-34.7±6.2　50.2±3.1　44.9±12.1　5.2±1.8模型　500　209.6±20.9**　154.6±21.3**　97.1±19.9**　13.2±3.0**

2.3 原代分离小鼠肝细胞的细胞形态 细胞体外培养2 d后开始贴壁，形态呈圆形或椭圆形，细胞轮廓清晰；体外培养4 d后，细胞呈多边形，可见单核、双核细胞，核仁清晰可见。见图2。

2.4 腺苷A1R、A2AR、A3R、A2BR在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型中的表达情况 与空白对照组比较，模型组腺苷A1R、A2AR的表达明显升高（P ＜0.01），A3R、A2BR表达未见明显变化。见图3、4。

2.5 cAMP-PKA信号通路在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤中的作用 与空白对照组比较，模型组cAMP含量及其信号通路中关键信号分子PKA、p-CREB蛋白的表达明显升高（P＜0.05），见图5、6、7。

3　讨论

肝细胞是肝脏的实质细胞，占肝脏体积及数量的80%，是肝脏正常功能活动的物质基础。肝细胞内代谢活跃，除合成人体必需的营养物质，同时还代谢外源性和内源性物质，如药物、毒物、胆红素、激素等，并制造和分泌胆汁参与消化过程。肝细胞中存在ARs，腺苷是内源性嘌呤核苷，通过与ARs结合，促进cAMP合成，激活PKA，对多种细胞中的酶或蛋白质进行磷酸化修饰，从而导致底物蛋白的功能发生改变［2］。ARs分为4个亚型：A1R、A2AR、A2BR、A3R，其中A1R和A2AR是高表达受体。在正常生理状态下，胞内外的腺苷浓度很低，而在各种应激情况下，腺苷浓度大幅度提升。本研究结果显示当肝细胞受到过量对乙酰氨基酚刺激时，腺苷A1R和A2AR的基因和蛋白表达水平明显增加，证实腺苷A1R和A2AR在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤发病机制中发挥作用。

cAMP-PKA通路是细胞内信号转导的主要途径，调节细胞内的生物活性反应和平衡。有文献［11］报道，在肝脏炎性疾病的发病机制中，激活肝细胞内腺苷酸环化酶诱导的cAMP-PKA通路可以抑制肝脏内NO合成酶的过度合成。G蛋白耦联受体的活化促进cAMP升高，激活PKA，PKA催化亚基转位入细胞核，使CREB磷酸化，从而导致底物蛋白的功能发生改变［12］。Gi／o和Gs蛋白属于G蛋白耦联受体家族，均参与细胞增殖活化并发挥重要作用［13］。本研究进一步探讨对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型中cAMP-PKA通路中关键信号分子PKA、磷酸化CREB蛋白的表达。结果显示，与空白对照组相比，模型组PKA、磷酸化CREB蛋白的表达均增加。

在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型中，腺苷A1R和A2AR表达水平均较空白对照组明显增强，表明腺苷A1R和A2AR共同参与肝脏损伤过程。有研究［14］表明，Gs蛋白的激活可增加cAMP的产

生，而Gi／o蛋白的激活则抑制了cAMP的产生；腺苷A1R和A2AR分别通过Gi／o和Gs蛋白对cAMP的含量产生影响。本研究显示空白对照组腺苷A2AR的含量高于A1R，模型组肝细胞中cAMP的含量高于空白对照组，由此推测腺苷A2AR介导的cAMP信号通路在对乙酰氨基酚致药物性肝损伤模型中占主导地位。上述有关对乙酰氨基酚诱导的腺苷信号强度加强进而促进药物性肝损伤的实验结果，证实了一种潜在的对乙酰氨基酚导致肝损伤的发生机制。

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Effect of adenosine receptors and cAMP-PKA signaling pathway mediated by adenosine receptors in the model of paracetamol-induced hepatotoxicity

Zhao Han，Ding Liping，Lv Xiongwen，et al
（College of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

AbstractObjective To explore the effect of adenosine receptors and cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A（cAMP-PKA）signaling pathway mediated by adenosine receptors in the model of paracetamol-induced hepatotoxicity.Methods Thirty male Kunming mice were randomly divided into normal control group and model group.Model group was treated with paracetamol 500 mg／kg and control group was treated with the same of concentration normal saline by intragastric administration，respectively.The mice were killed after 24 hours.Serum AST，ALT，ALP，TBA were measured.The histological analysis was performed by HE staining.Hepatocytes were extracted and purified from mice in the liver，followed by the method of in situ perfusion.The expression levels of adenosine A1 receptor（A1R），adenosine A2A receptor（A2AR），adenosine A2B receptor（A2BR）and adenosine A3 receptor（A3R）were detected using qRT-PCR and Western blot.The expression levels of cAMP，PKA and phosphorylation-cAMP response element bonding protein（p-CREB）were detected using ELISA and Western blot，respectively.Results The expression levels of AST，ALT，ALP，TBA in model group were much higher than the normal control group（P＜0.01）.The mRNA and protein levels of A1R and A2AR expressed in the mod-

el group were obviously higher than the normal control group（P＜0.01），and the cAMP level in the model group was more than in the normal control group（P＜0.01）.The protein levels of PKA and p-CREB expressed in the model group were higher than the normal control group.Conclusion Paracetamol-induced hepatotoxicity may be involved with the cAMP-PKA signaling pathway.

Key wordsparacetamol；hepatotoxicity；adenosine receptors

作者简介：赵 晗，女，硕士研究生；吕雄文，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：lxw31288＠aliyun.com

基金项目：国家自然科学基金项目（编号：81270498）；国家级大学生创新创业训练计划项目（编号：201410366043）

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）05-0616-05

中图分类号R 961；R 965.2