塞来昔布对人成骨细胞增殖的影响及其作用机制

高 杰，桂斌捷，胡孔足，王斯晟

塞来昔布对人成骨细胞增殖的影响及其作用机制

高 杰，桂斌捷，胡孔足，王斯晟

摘要目的 观察塞来昔布对人成骨细胞增殖的影响及其作用机制。方法 将人成骨细胞分为3个组：空白对照组、IL-1刺激组（阴性对照组）、塞来昔布＋IL-1刺激组（药物干预组），用RT-PCR法和Western blot法分别检测三组成骨细胞环氧化酶-2（COX-2）、膜相关前列腺素E2合成酶1 （mPGES-1）mRNA和蛋白的表达。MTT法检测塞来昔布对阴性对照组人成骨细胞增殖的影响。结果 RT-PCR法和Western blot法实验结果显示，同空白对照组相比，阴性对照组的人成骨细胞中COX-2、mPGES-1 mRNA和蛋白的表达均增加；同阴性对照组相比，药物干预组的COX-2、mPGES-1 mRNA和蛋白的表达均降低。塞来昔布对IL-1刺激的人成骨细胞的生长具有抑制作用，呈现剂量依赖性，浓度越大，抑制作用越大；并且随着作用时间的延长，细胞的抑制作用增大。结论 塞来昔布可以抑制炎性状态下人成骨细胞的生长，可能是通过调控COX-2、mPGES-1 mRNA和蛋白的表达，使其表达下调而发挥作用。

关键词环氧化酶-2；塞来昔布；成骨细胞；异位骨化

2015-03-09接收

作者单位：安徽医科大学第一附属医院骨科，合肥 230000

异位骨化是指在软组织出现成骨细胞，并形成骨组织。研究［1-2］表明环氧化酶-2（cyclooxyenase-2，COX-2）和膜相关前列腺素E2合成酶（membraneassociated PEG2 synthase，mPGES-1）是花生四烯酸生成前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）过程的重要催化酶，PGE2可以让原始的间充质干细胞诱导分化成成骨细胞，促进成骨细胞的生长，并能调节破骨细胞的分化和功能，提示COX-2和mPGES-1可能对异位骨化的形成发挥重要作用。研究［3-4］表明IL-1能够刺激人成骨细胞的COX-2及mPGES-1的表达，参与细胞病理及炎性过程。该研究用COX-2选择性抑制剂塞来昔布抑制COX-2和mPGES-1的表达，减少PGE2的生成，研究塞来昔布在炎性状态下对成骨细胞中COX-2、mPGES-1 mRNA和蛋白表达的影响，同时观察不同浓度的塞来昔布对炎性状态下成骨细胞增殖的影响，探讨COX-2和mPGES-1对成骨细胞增殖分化的作用和对异位骨化可能的影响，旨在为临床预防和治疗异位骨化提供新的理论依据。

1　材料与方法

1.1 材料 人成骨细胞购自中科院上海细胞库；塞来昔布购自中国辉瑞制药有限公司；无水乙醇溶液、氯仿、异丙醇、甲醇溶液、甘氨酸均购自上海国药集团；白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自杭州四季青生物材料有限公司；胰蛋白酶购自上海碧云天生物技术有限公司。PBS为本实验室自己配置，TRIzol试剂购自美国Invitrogen生物公司，逆转录试剂盒及RT-PCR试剂盒均购自Sigma生物试剂公司；COX-2和mPGES-1单抗均购自美国Proteintech Group公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和鼠、兔二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Marker购自美国Thermo Scientific公司；BCA蛋白定量试剂盒购自原平皓生物技术有限公司。

1.2 主要仪器 稳压稳流蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司；ELX-800型光吸收酶标仪购自美国Bio-Tek公司；PCR扩增仪购自德国Biomatra公司；凝胶密度扫描仪、紫外投射仪均购自上海Tanon科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 人成骨细胞培养于DMEM培养液（90%）和胎牛血清（10%）混合培养基中贴壁生长，在5%CO2、37℃的温箱中培养。2～3 d传代一次，使保持细胞处于对数生长期。

1.3.2 RT-PCR法检测塞来昔布对成骨细胞增殖的影响 实验将处于对数生长期的人成骨细胞用胰酶消化后，用DMEM培养基配制成细胞密度为1× 105个／ml的细胞悬液分别加入到6孔板中，待细胞贴壁后将其分为3组：空白对照组、IL-1刺激组（阴性对照组）、塞来昔布＋IL-1刺激组（药物干预组），IL-1的浓度为10 ng／ml，塞来昔布的浓度为20

μmol／L，处理24 h后，取出处理的人成骨细胞，弃培养液，加PBS轻轻地洗涤3遍，吸净PBS，加入TRIzol，以10 cm2／ml为标准。放置10 min使细胞充分裂解，然后经氯仿处理，异丙醇沉淀，75%乙醇溶液洗涤，干燥，加入20 μl的DEPC水将沉淀溶解，利用紫外分光光度计测量RNA的浓度及OD260／OD280的比值，比值一般在1.8～2.0表示RNA的质量好，可以用于下一步的实验。取质量好的RNA按照TaKaRa逆转录试剂盒的说明配置逆转录反应液，将RNA逆转录为cDNA。测量cDNA的浓度，计算3组的cDNA总量，将要进行RT-PCR的3组cDNA总量保持一致。RT-PCR按25 μl反应体系进行。COX-2 mRNA上游引物：5’-TTCGGGAGCACAACAGAGTG-3’，下游引物：5’-TAACCGCTCAGGTGTTGCAC-3’；mPGES-1 mRNA上游引物：5’-TAGCCATATTGGAGATGCTGTGG-3’，下游引物：5’-TCAGAGCAAAAGTTAGCTGAACTGG-3’；上游引物：5’-GCCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3’，GAPDH下游引物：5’-GAAGGCAGCCCTGGTAACC-3’。反应条件：95℃预变性15 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物于1.5%的琼脂糖凝胶板稳压电泳（120 V／100 Ma，40 min），经数码凝胶图像定量分析系统及凝胶密度扫描机成像处理系统成像、条带密度扫描。

1.3.3 Western blot法检测塞来昔布对成骨细胞增殖的影响 将处于对数生长期的人成骨细胞转移到3张6孔板中，依次将3张培养板分为3组：空白对照组、IL-1刺激组（阴性对照组）、塞来昔布＋IL-1刺激组（药物干预组），加药24 h后收集细胞，加入适量的细胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃离心30 min，提取蛋白。以BCA法进行蛋白定量，120℃蛋白变性5 min，每组的蛋白上样量为20 μg，上样后用120 V电泳45 min，然后用100 V转膜1 h，含5%脱脂牛奶TBST液封闭2 h，孵育COX-2和mPGES-1单抗4℃过夜，TBST清洗3次，每次15 min。加入辣根酶标记的鼠或兔二抗孵育1 h，TBST清洗干净后，于曝光仪中涂上发光剂曝光，并保存图像。

1.3.4 MTT法检测塞来昔布对成骨细胞增殖的影响 取生长状态良好的人成骨细胞于6孔板中，加入浓度为10 ng／ml的IL-1处理细胞，继续培养24 h后，调整细胞密度为5×104个／ml，接种到96孔板中，每孔加入细胞悬浮液100 μl，过夜培养。待细胞生长至80%～90%细胞密度时，在实验组的每孔中加入不同浓度的COX-2抑制剂塞来昔布，分别干预24、48 h（以上每个组设置4个复孔），同时设置调零孔和不加药物干预的空白对照孔。塞来昔布的浓度分别为（0、20、40、60、80、100 μmol／L），在培养板的每孔加入20 μl的MTT（5 mg／ml），37℃条件下避光孵育4 h后结束培养，小心的吸去上清液，每孔加入150 μl DMSO，在摇床上低速振荡15 min，使孔内的结晶充分溶解后，在酶联免疫酶标仪上测定570 nm波长处各孔光密度（optical density，OD）值，取4个复孔的平均值。按照以下公式计算细胞的抑制率：细胞增殖抑制率（%）＝（1-OD实验组平均值／OD对照组平均值）×100%。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件进行分析，实验数据采用±s表示，单变量两组之间的比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析。

2　结果

2.1 塞来昔布对成骨细胞中COX-2 mRNA、mPGES-1 mRNA表达的影响 所有阴性对照组、阳性对照组、药物干预组的成骨细胞经TRIzol裂解提取后进行RNA检测。总RNA经紫外分光光度计测量，各组OD260／OD280为1.8～2.0，RNA质量较好，表明无DNA和蛋白质污染，OD230／OD260为1.2～1.6，表明盐离子清洗干净，残留较少。RT-PCR检测3组细胞的COX-2、mPGES-1 mRNA的表达结果显示：IL刺激人成骨细胞后，细胞内的COX-2、mPGES-1 mRNA的表达增加；塞来昔布作用于IL-1刺激组的人成骨细胞使COX-2、mPGES-1 mRNA的表达降低，见图1。

2.2 塞来昔布对成骨细胞中COX-2、mPGES-1蛋白表达的影响 同空白对照组相比，阴性对照组成骨细胞中COX-2、mPGES-1蛋白表达增加；同阴性对照组相比，药物干预组COX-2、mPGES-1蛋白表达降低（F1＝1.54、F2＝2.92，P＜0.05）。见图2。

2.3 塞来昔布对成骨细胞增殖的影响 实验结果显示塞来昔布对炎性状态下人成骨细胞的增殖具有抑制作用，48 h的细胞增殖抑制率高于24 h的细胞增殖抑制率；不同浓度的塞来昔布作用于成骨细胞表现为随着塞来昔布浓度的增加，其抑制率呈上升趋势，差异具有统计学意义（F＝22.86，P＜0.05），见表1、图3。

表1　不同浓度的塞来昔布分别在24 h和48 h对成骨细胞生长的影响（±s）

表1　不同浓度的塞来昔布分别在24 h和48 h对成骨细胞生长的影响（±s）

与48 h比较：*P＜0.05

塞来昔布浓度（μmol／L）24 h OD570　　抑制率（%）48 h OD570　　抑制率（%）0　1.02±0.26　0　1.16±0.34　0 20　0.95±0.19　6.86±0.84*　1.02±0.26 11.65±2.00 40　0.83±0.13 18.80±1.67*　0.89±0.30 23.44±3.22 60　0.74±0.22 31.25±2.61*　0.71±0.06 38.96±3.75 80　0.62±0.31 39.70±3.50*　0.61±0.73 47.53±2.36 100　0.54±0.17 46.88±2.25*0.53±0.40 54.20±2.28

3　讨论

绝大部分组织细胞COX-2在正常情况下的表达很低，在炎症、创伤等多种刺激因子作用下可以诱导其高表达［5-6］，并且mPGES-1受COX-2诱导产生高表达。研究［7-8］表明COX-2和mPGES-1是花生四烯酸生成PGE2过程的重要催化酶，PGE2可以让原始的间充质干细胞诱导分化成成骨细胞，促进成骨细胞的生长，并能调节破骨细胞的分化和功能。研究［9-10］显示异位骨化是一种病理性的骨形成，多由创伤、感染等刺激诱发多见，成骨细胞在炎症状态下的COX-2高表达，提示COX-2和mPGES-1可能对异位骨化的形成发挥重要作用。COX-2选择性抑制剂能够选择性地抑制COX-2的活性和mPGES-1表达，从而减少其生成，PGE2的合成减少进一步使成骨细胞的分化和生成降低。研究［11］显示，塞来昔布能够逆转PGE2引起的糖蛋白降解及抑制糖蛋白合成的作用，保护机体糖蛋白。因此，从多方面多角度抑制PGE2的合成，从而抑制成骨细胞的分化和过度增殖，成为临床治疗患者异位骨化的重要途径。本研究显示同空白对照组相比，阴性对照组COX-2、mPGES-l mRNA和蛋白表达增加；同阴性对照组相

比，塞来昔布干预组COX-2、mPGES-1 mRNA和蛋白表达下调，表明IL-1刺激成骨细胞中的COX-2、mPGES-1表达增高，而塞来昔布能够明显抑制COX-2、mPGES-1在炎性状态下的成骨细胞的表达，从而能够抑制PGE2的合成，达到抑制人成骨细胞的生成和分化作用。同时本实验用MTT法观察不同浓度不同时间点的塞来昔布是否能影响IL-1刺激的高表达COX-2、mPGES-1的人成骨细胞的生长，实验结果显示塞来昔布对高表达COX-2、mPGES-1的人成骨细胞的生长具有抑制作用，随着时间的延长，成骨细胞的增殖率越来越低，48 h的细胞增殖抑制率高于24 h的细胞增殖抑制率；而不同浓度的塞来昔布作用于成骨细胞表现为随着塞来昔布浓度的增加，其增殖抑制率呈上升趋势。

综上所述，塞来昔布能够抑制人成骨细胞的生长，可能与其通过抑制COX-2、mPGE-1 mRNA和蛋白表达从而抑制成骨细胞的分化和增殖有关，为临床异位骨化的治疗与研究提供依据。

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Study on the impact of celecoxib on proliferation of human osteoblasts

Gao Jie，Gui Binjie，Hu Kongzu，et al
（Dept of Orthopaedics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

AbstractObjective To study the impact of celecoxib on proliferation of human osteoblasts.Methods The human osteoblasts were cultured and divided into three groups，including the negative control，positive control（stimulated by IL-1）and intervention group（celecoxib＋IL-1）.The detection of mRNA and protein level of COX-2 and mPGES-1 were measured by real tmie PCR（RT-PCR）and Western blot.MTT assay was performed to determine the impact of celecoxib on proliferation of human osteoblasts which were treated with IL-1.Results RT-PCR and Western blot showed that the detection of mRNA and protein level of COX-2 and mPGES-1 of the positive control （stimulated by IL-1）were significantly higher than that of the negative control and intervention group（celecoxib＋IL-1）.Celecoxib had cytotoxic effect on the growth of osteoblasts，manifests dose dependence as well as increasing cell inhibition over time.Conclusion Celecoxib could inhibit proliferation of osteoblasts，and could inhibit the occurrence of heterotopic ossification by regulating the level of mPGES-1 and COX-2 mRNA and protein.

Key wordsCOX-2；celecoxib；osteoblasts；heterotopic ossification

作者简介：高 杰，男，硕士研究生；桂斌捷，男，教授，副主任医师，硕士生导师，责任作者；E-mai：guibinjie12＠163.com

基金项目：安徽省自然科学基金（编号：1408085MH182）

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）05-0608-04

中图分类号R 681.8