穿膜肽介导p53抗原多肽致敏DC的体外抗瘤效应

孙青山 贾原 张俊萍

·基础研究·

穿膜肽介导p53抗原多肽致敏DC的体外抗瘤效应

孙青山 贾原 张俊萍

目的探讨细胞穿膜肽(cpps)介导p53致敏树突状细胞(DC)获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，检测其体外对结肠癌细胞株的杀伤效果。方法抽取健康志愿者外周血50ml，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，经细胞因子诱导，获得DC细胞和T淋巴细胞。将Tat49－57－p53264－272致敏DC细胞，待DC细胞成熟后与T淋巴细胞混合诱导产生CTL，并设PBS与P53为对照。流式细胞术检测致敏前后DC细胞的表型，并采用乳酸脱氢酶(LDH)法检测抗原肽疫苗致敏DC后获得CTL对结肠癌细胞株DLD1的体外杀伤活性，同时与人白血病细胞株jurkat的杀伤作用进行比较。结果致敏前DC中CD80、CD86表达率分别为(15．9±2．1)%、(19．1±2．3)%，而致敏后分别为(17．4±1．7)%、(18．7 ±1．1)%，致敏前后比较差异无统计学意义，P＞0．05。实验组穿膜肽可延长p53抗原多肽在DC细胞内半衰期，从而增强与DC细胞质内的MHC I类分子的结合率，并提呈到细胞表面。实验组CTL对结肠癌DLD1细胞的杀伤能力显著强于对照组，且随着效靶比的增加，杀伤活性逐渐增强(P＜0．05)。Tat49－57－p53264－272多肽致敏DC活化CTL对DLD1细胞具有特异性杀伤作用，对DLD1的杀伤作用显著强于jurkat细胞(P＜0．05)。结论穿膜肽可以增强p53抗原多肽的免疫原性，Tat49－57－p53264－272多肽致敏DC能有效诱导抗结肠癌DLD1细胞的特异性免疫应答。

结肠癌;树突状细胞;细胞穿膜肽;p53;肿瘤免疫治疗

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:949～953)

p53基因作为抑癌基因，当发生缺失或突变后可促使细胞无限制生长，对肿瘤发生、发展起重要作用。研究显示p53蛋白在结肠癌中的突变率达到50%［1］，因此可为结肠癌的早期诊断和治疗提供新的靶点。突变的p53蛋白常常在肿瘤细胞中稳定的过度表达，大量临床研究证实过表达的p53蛋白具有免疫原性可诱导特异性的CTLs［2－3］。因此，p53蛋白理论上可作为肿瘤抗原成为肿瘤特异性免疫治疗的靶标。

细胞穿透肽(CPPs)，能够穿透细胞膜携带大分子物质进入不同性质的活细胞内［4］。CPPs作为1种细胞渗透性多肽，可携带多种物质，如DNA，RNA，多肽，蛋白，小分子化合物等，具有广泛的组织相容性、稳定性、低毒性和低免疫原性、可人工合成相对简便等［5］优点。Wangrongfu等［6］报道显示，利用CPPs可显著提升HLA限制性多肽的DC细胞穿膜效率，且半衰期显著延长。一系列的研究显示，由此引发的CTL免疫效应能高表达CD8+T淋巴细胞表达，同时IFN－y，GMCSF的表达水平都显著提高。说明该CPPs是有效的。

本研究拟采用细胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPPs)携带p53抗原多肽致敏DC获得抗原特异性CTL，检测其体外对结肠癌细胞株的杀伤效果，探索1种疗效更明显、更安全、免疫反应更具有特异性的p53疫苗提供新思路。

1 材料与方法

1．1 细胞和多肽

结肠癌细胞株DLD1和白血病细胞株Jurkat由本实验室保存。p53抗原多肽p53264－272LLGRNSFEV(L9 V)［7］，Tat49－57－p53264－272多肽(RKKRRQRRR－LLGRNSFEV)购自北京赛百盛基因技术有限公司。

1．2 试剂和耗材

CD3 McAb(古巴分子免疫中心)，rhGM－CSF(辽宁卫星生物制品研究所)，rhIL－4(peprotech公司)，rhIL－2 (北京四环生物制药)，RPMI 1640(赛默飞世尔生物有限公司)，DMEM培养基(上海恒远生物科技有限公司)，10%的胎牛血清(杭州四季青)，Ficoll分离液(天津灏洋)，FITC标记CD80mAb，PE标记CD86 mAb，FITC标记Tat49－57－p53264－272，FITC标记p53264－272均自备，CO2培养箱(Thermo)，荧光倒置显微镜(奥林巴斯)，离心机(长沙湘智)，流式细胞仪(美国BD公司)。

1．3 树突状细胞的培养及流式细胞仪检测

采集健康志愿者外周血50 ml，肝素钠(10 ml)抗凝。加入等量淋巴细胞分离液于4℃、2 100 r/min、离心10 min。吸取单个核细胞层，加入0．9%氯化钠50 ml混匀，离心去除淋巴细胞分离液。经淋巴细胞分离液密度梯度离心获得外周血单个核细胞，悬浮于1640培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养3～6 h，贴壁细胞即为DC前体细胞，加入GM－CSF(800 U/ml)和IL－4(1 000 U/ml)继续培养，隔天半量换液，第5 d加入TNF－α(20 ng/ml)诱导成熟DC;并收集成熟DC应用流式细胞仪检测，于第7天收获细胞备用。

1．4 淋巴细胞的培养

取未贴壁的细胞加入175 cm2细胞培养瓶培养，调整细胞浓度为1×105/mL，加入含10 IU/mL IL－2的AIM－V培养液，于37℃、5%CO2环境中培养，隔日半量换液，培养第7天收获淋巴细胞备用。

1．5 荧光倒置显微镜观察

荧光异硫氰酸荧光素(FITC)标记。脱盐柱纯化收集多肽。

将制备的抗原多肽(p53264－272，CPP－p53264－272，浓度为1 mg/ml)，与用0．1 mol·L－1NaHCO3－NaOH pH 9．0配制的100 mmol·L－1Fluorescein－5－isothiocyanate (FITC)溶液混合标记，4℃避光过夜反应。反应混合液再经凝胶柱(P10)脱盐去除多肽样品中游离的FITC，用Hepes缓冲液(0．02 mol·L－1Hepes，pH7．4，0．1 mol·L－1NaCl，1 mmol·L－1DTT)洗脱，并根据公式［protein］=［A280－A494×0．3］/ε计算偶联FITC的多肽浓度。实验组树突状细胞(dendritic cell，DC)和对照组DC，于培养的第7 d分别加入FITC－Tat49－57－p53264－272抗原多肽和FITC－p53264－272(终浓度为100 ng/ ml)，37℃、5%CO2环境中孵育2 h。经洗涤后荧光镜下观察半衰期和荧光强度。

1．6 DC表型的检测

弃上清培养液，加DC培养液(1640培养基+ 10%血清+1 000 U/ml IL－4，1 000 U/ml GM－CSF)，并加入TNF－a用于刺激DC细胞成熟。取培养树突状细胞，调整细胞密度至106个/mL，加入荧光抗体CD80－FITC和CD86－PE，避光放置30 min，洗涤3次上流式细胞仪(FCM)检测。

1．7 DC－T细胞共同培养诱导特异性CTL

第9 d，将刺激成熟的DC细胞与T淋巴细胞混合培养。同时计数。共培养5 d。隔天换液(1640培养基+10%血清+1 000 U/ml，120 IU IL－2)。第15 d时，计数细胞。同时对培养物进行流失细胞检测。

1．8 CTL在体外的杀伤实验及活性的检测

效应细胞CTL与靶细胞DLD1细胞混合放入U型96孔酶标板中，反应体系为200 μl，设置3个平行复孔，每孔加入1×105个靶细胞，效靶比分别为10∶1、20∶1、50∶1，然后以1 200 r/min离心2 min，37℃5%CO2分别孵育4 h，每孔加入6 μl置于冰浴5 min，洗涤3次，应用流式细胞仪检测杀伤活性。

1．9 LDH法检测CTL细胞对结肠癌细胞株DLD1的杀伤作用

以DC－CTL细胞为效应细胞，肿瘤细胞DLD1为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10∶1、20∶1、50∶1的比例加入96孔U型板中，每孔含靶细胞1×104个，终体积为200 ml，设3个复孔。于37℃、5%CO2孵育箱中混合培养4 h后，用冷1 640培养液50 μl/孔，中止效应细胞与靶细胞反应，1 500 r/min，离心5 min，收集上清，加入LDH反应液，每孔100 μl，室温避光孵育30 min后，每孔加1 mol/L HCl 50 μl终止酶促反应，去除孔中含有的气泡，1 h内检测吸收值(490 nm)，取3孔均值。计算CTL杀伤率，细胞杀伤率(%) =［(实验组释放－效应细胞自发释放－靶细胞自发释放)/(靶细胞最大释放－靶细胞自发释放)］×100%。

1．10 统计学处理

2 结果

2．1 cpp－p53致敏DC后形态及荧光强度

从培养第2～3 d后DC细胞形态出现不规则改变，体积变大，周边可见少量细小树突状突起。第5 d加入rhTNF－α后细胞体积增大，细胞表面出现大量毛刺状突触，部分细胞开始悬浮，聚集成大小不等的细胞团，呈典型的树突状细胞形态，与正常DC相比，无明显差异，提示Tat49－57－p53264－272致敏并不影响DC的生长。第7 d将FITC－ccp－p53和FITC－p53分别与成熟的DC细胞共同培养2 h，在荧光倒置显微镜下观察，可见cpp－p53穿膜进入DC的效果要明显强于单纯p53。激光共聚焦显微镜下观察发现实验组(FITCCPP－P53)荧光强度显著强于对照组(图1A)，结果显示，P53致敏的DC，其荧光猝灭速度快于CPP－P53、FITC－p53，其半衰期大约为2．5 h，而FITC－CPP－P53半衰期约为10 h(图1B)。上述结果说明，CPP－P53具有较高的穿膜效率，能长时间滞留在DC细胞内。

图1 荧光图

2．2 Tat49－57－p53264－272致敏DC后的表型

Tat49－57－p53264－272致敏DC后CD80 CD86表达率无显著性增高［(15．9±2．1)%vs(17．4±1．7)%，(19．1±2．3)%vs(18．7±1．1)%，P＞0．05］，显示CPP抗原肽的致敏对DC表型无显著影响，说明CPPP53致敏DC是通过其穿膜效应促进抗原肽进入DC细胞膜，而不影响DC成熟(图2)。

2．3 DC诱导CTL活化及表型分析

DC培养成熟后与T淋巴细胞共培养，定期观察，倒置显微镜下显示T淋巴细胞显著扩增，且随着细胞数量的增加出现聚团集落。流式细胞术检测抗原肽致敏DC后体外诱导CTL表型，结果显示，CPP－P53组较单纯P53组及空白组，CD3+CD8+细胞明显增加［(73．4±9．18)%vs(58．1±8．43)%］(P＜0．05)，

有统计学意义(表1，图3)。

表1 CTL亚群表型分析/%

图3 T细胞亚型分析

2．4 LDH测定CTL杀伤活性

效靶比相同时，经Tat49－57－p53264－272致敏DC细胞诱导产生的CTL对DLD1细胞的杀伤率高于实验组和空白对照(P＜0．05)。且随着效靶比的增加杀伤活性也随之增强(表2，图4)。在效靶比一定时，空白对照组对DLD1细胞和jurkat细胞的杀伤活性无明显差异，而Tat49－57－p53264－272致敏DC和p53264－272致敏DC诱导产生的CTL对DLD1细胞的杀伤活性均强于对jurkat细胞的杀伤活性，且Tat49－57－p53264－272显著高于p53264－272的杀伤活性，其差异有显著性，P＜0．05(图5)。

表2 CTL对DLD1细胞杀伤率比较(±s，%)

表2 CTL对DLD1细胞杀伤率比较(±s，%)

注:CPP－p53与p53组比较，P＜0．05;PBS与CPP－p53比较，P＜0．05。

10∶120∶150∶1 CPP－p53组组别效靶比4．1±1．36．9±2．79．7±3．4 14．4±8．622．2±7．936．9±8．2 p53组12．1±3．315．8±4．723．4±6．9 PBS组

图4 CPP－p53和p53致敏后DC诱导的CTL及PBS对DLD1细胞的杀伤率

图5 TCPP－p53和p53致敏后DC诱导的CTL及PBS对DLD1和Jurkat细胞的杀伤率

3 讨论

p53蛋白1979年首次发现，是人类细胞中最重要的抑癌基因之一，野生型p53基因具有抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡的作用。研究资料表明野生型p53基因是一个重要的抑癌基因，在50%～70%的结肠癌中有突变［7－8］。且这些突变的p53蛋白往往在肿瘤细胞内稳定过度表达，而在正常细胞内p53很少内p53很少内p53很少或检测不到［9］。肿瘤细胞内堆积的p53蛋白降解产物可以与MHCⅠ类和Ⅱ类分子结合，在肿瘤细胞表面呈递，从而被特异性CTL识

别，使针对肿瘤细胞p53的机体免疫成为可能［10］。

DC细胞是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。人类恶性肿瘤约50%有p53突变，因此其成为肿瘤免疫疗法潜在的靶向抗原。在大多数试验中，以p53作为肿瘤特异性抗原疫苗诱导的特异性免疫反应能观察到，但不是很明显［11］。其中的关键的原因就是与p53抗原肽的免疫原性低有关，p53蛋白稳定性差在体内易降解［12］，与DC的结合率较低。所以解决的关键就在于增强p53蛋白的稳定性和提高p53与DC的结合率。

CPPs是1种由30个或者更少氨基酸组成的能够穿透细胞膜的多肽，能够运载包括药物在内的许多物质。CPPs是一类以非受体依赖方式，非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽，能够运载多种生物学活性物质进入细胞内，并发挥相应的生物学活性和治疗作用，其转导效率高且不会造成细胞损伤［13］。这一特性保证了CPPs携带各种大分子物质进入细胞内的高效输送。

本研究中，经Cpp－p53致敏DC多肽疫苗活化的诱导产生的CTL对高表达p53的结肠癌细胞株DLD1的杀伤力显著高于jurkat。表明所产生的p53特异性的CTL对p53高表达的结肠癌细胞具有特异性的杀伤作用。在效靶比相同的情况下，Cpp－p53致敏DC多肽疫苗活化的诱导产生的CTL对DLD1细胞的杀伤活性明显高于对照组，表明CPPs可以有效的携带p53抗原肽进入DC细胞，延长p53抗原肽在细胞内的降解和延缓其半衰期从而增强其与DC细胞的结合，通过MHCⅠ类分子途径有效地提呈肿瘤特异性抗原，并活化T细胞从而产生对相应肿瘤细胞具有特异性的CTL。以上结果表明Cpp－p53致敏DC细胞能诱导强大的抗结肠癌癌细胞株DLD1的免疫作用，为Cpp－p53致敏DC疫苗在结肠癌癌免疫治疗的体内试验和临床应用研究提供了实验依据。

激光共聚焦显微镜下观察显示实验组(FITC－CPP－p53)荧光强度显著高于对照组，且p53致敏的DC荧光猝灭速度远快于CPP－p53，而FITC－CPP－p53半衰期约为FITC－p53 4倍。上述结果说明，CPP－p53具有较好的穿膜效率，能长时间滞留在DC细胞内，且可以通过细胞内内质网上合成的MHC－Ⅰ类分子提呈抗原多肽分布于细胞膜表面上，发挥其穿膜效应，而这与一般APC细胞提呈多肽类疫苗作用机制不同(APC细胞通过膜上MHC－Ⅱ类分子提呈抗原)，因此CPP－p53致敏DC实际上可能存在2种机制(MHC－Ⅰ，MHC－Ⅱ)共同作用的结果，①通过CPP穿膜提呈MHC－Ⅰ类分子;②P53与DC细胞膜上MHC－Ⅱ类分子直接结合提呈到TCR。而上述过程可能并不涉及DC细胞的成熟，而是通过2种机制致敏并提呈TCR。

总之，我们采用Tat49－57－p53264－272致敏DC疫苗的策略得到了很好的验证，说明CPPs可以增强肿瘤抗原肽的免疫原性，在肿瘤疫苗的研究中具有巨大的潜在价值。本实验将CPPs与肿瘤相关抗原向结合，以p53蛋白为例，刺激树突状细胞以获得特异性CTL，进而开发1种有效的肿瘤疫苗。本实验目的在于以体外实验为基础，最终达到临床应用。而仅以p53单一对象涉及肿瘤疫苗具有一定的局限性。多抗原协同作用，多种CTL相互结合是我们的最终目的。因此在后续试验中，将CEA、HER2、MAGE3等抗原与CPP联合应用，形成一个更加有效的肿瘤DC疫苗。

［1］陈奇，曾照芳．p53基因突变与消化系统恶性肿瘤的关联〔J〕．激光杂志，2012，33(2):79－80．

［2］de Vries A，Flores ER，Miranda B，et al．Targeted point mutations of p53 lead to dominant－negative inhibition of wildtype p53 function〔J〕．Proc Natl Acad Sci USA，2002，99 (5):2948－53．

［3］Shan，SG，Bao YF，Chen XJ．Research progress in anticancer immunotherapy of wild－type p53 peptides〔J〕．J Chin Oncol，2011，17(8):630－632．

［4］Mäger I，Langel K，Lehto T，et al．The role of endocytosis on the uptake kinetics of luciferin－conjugated cell－penetrating peptides〔J〕．Biochim Biophys Acta，2012，1818(3):502－511．

［5］Matsuzaki K，Sugishita K，Miyajima K．Interactions of an antimicrobial peptide，magainin 2，with lipopolysaccharidecontaining liposomes as a model for outer membranes of gram－negative bacteria〔J〕．FEBS Lett，1999，449(2/3): 221－224．

［6］Wang RF，Wang HY．Enhancement of antitumor immunity by prolonging antigen presentation on dendritic cells〔J〕．Nat Biotechnol，2002，20(2):149－154．

［7］Dong SM，Traverso G，Johnson C，et al．Detecting colorectal cancer in stool with t he use of multiple genet ic targets〔J〕．J Natl Cancer Inst，2001，93(1):858－865．［8］Tagore K，Lawson M，Yucaitis J，et al．Sensitivity and specificity of a stool DNA multitarget assay panel for the detection of advanced colorectal neoplasia〔J〕．Clin Colorectal Cancer，2003，3(1):47－53．

［9］Roxburgh P，Hock AK，Dickens MP，et al．Small molecules that bind the Mdm2 RING stabilize and activate p53〔J〕．Carcinogenesis，2012，33(4):791－798．

［10］Bowne WB，Wolchok JD，Ha wkins WG，et al．Injection of DNA encoding granulocyte－macrophage colony－stimulating factor recruits dendritic cells for immune adjuvant effects〔J〕．Cytokines Cell Mol Ther，1999，5(4):217－225．

［11］Vermeij R，Leffers N，van der Burg S H，et al．Immunological and clinical effects of vaccines targeting p53－overexpressing malignancies〔J〕．J Biomed Biotechnol，2011，2011:702146．

［12］Tian J，Wang ZG，Ren JL，et al．Preparation of a new cellpenetrating peptides as gene vector〔J〕．Third Mil Med Univ，2011，33(24):2562－2566．

［13］任锦，钦传光，徐春兰，等．细胞穿膜肽作为药物载体的研究进展〔J〕．药学学报，2010，45(1):17－25．

Anti-tumor Effect of Penetrating Peptide-mediated p53 on Antigen Peptide Pulsed DC in vitro

SUN Qingshan，JIA Yuan，ZHANG Junping．Shanxi Academy of Medical Science，Shanxi Dayi Hospital，Taiyuan，030001

ObjectiveTo investigate the cell penetrating peptide to carry p53 antigen pulsed dendritic cells(DC)induced antigen specific cytotoxic T lymphocytes，and in vitro the killing effect on colon cancer cell lines．MethodsMononuclear cells were extracted form 50mL peripheral blood of healthy volunteers using lymphocyte separation liquid，using different cytokines induce cultured DC cells and T lymphocytes．Tat49－57－p53264－272antigen peptide were prepared，and poured into DC cells．DC was mixed with T lymphocyte to induce CTL，Phenotype were respectively detected in penetratin sensitized and unsensitized DC by flow cytometry，Lactate dehydrogenase detected the activity of DLD1 colon cancer cell lines that were killed by Tat49－57－p53264－272induced activation of CTL sensitive DC peptide vaccine，and compared with the killing effect on human leukemia cell line Jurkat．ResultsSensitization of former DC CD80，CD86 expression was respectively(15．9±2．1)%，(19．1±2．3)%，while after sensitization of DC CD80，CD86 expression was(17．4±1．7)%，respectively(18．7±1．1)%，the difference was not statistically significant，P＞0．05．The experimental group of cell penetrating peptide can prolong the half－life of P53 peptide antigen，enhanced binding and DC cell surface MHC class I molecules binding rate，and far higher than that in the control group(P＜0．05)．The experimental group cytotoxic lymphocyte on colon cancer DLD1 cell killing was significantly higher compared with the control group，and with the increase of effect or target ratio，killing activity increased gradually．The killing activity of Tat49－57－p53264－272was significantly higher than p53264－272(P＜0．05)．Cytotoxicity of Tat49－57－p53264－272sensitized DC polypeptide vaccine activated CTL with specific killing to DLD1 cells，the killing effect of DLD1 was significantly stronger than the killing effect on Jurkat cells(P＜0．05)．ConclusionMembrane penetrating peptides can enhance the immunogenicity of P53 peptide antigen，Tat49－57－p53264－272sensitized DC polypeptide vaccine can induce specific immune response against colon cancer DLD1 cells，and provide experimental basis for membrane penetrating peptides in further research and clinical application of tumor vaccine．

Colon cancer;Dendritic cells;Cell penetrating peptides;p53;Tumor immunotherapy

10．3969/j．issn．1001－5930．2015．07．001

R73－36

:A

:1001－5930(2015)07－0949－05

2014－04－08

2015－06－11)

(编辑:吴小红)

030001山西医科大学研究生院(孙青山);030001山西大医院肿瘤生物治疗科(孙青山，贾原，张俊萍)

张俊萍