EGCG对宫颈癌HeLa细胞增殖、侵袭及VEGF蛋白表达的影响

陈萍 邓守恒

EGCG对宫颈癌HeLa细胞增殖、侵袭及VEGF蛋白表达的影响

陈萍 邓守恒

目的研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对体外培养宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡和迁移的影响及其分子机制。方法采用MTT法检测EGCG对宫颈癌细胞增殖的影响;流式细胞法检测细胞凋亡及周期;细胞划痕法和Transwell法检测细胞体外侵袭;蛋白质免疫印迹法检测血管内皮生长因子(VEGF)表达水平。结果经EGCG处理后，HeLa细胞的增殖和侵袭能力明显受到抑制，凋亡率也显著增高;随着EGCG浓度升高，VEGF蛋白表达水平明显下降。结论EGCG可通过下调VEGF蛋白表达对宫颈癌细胞产生抑制增殖、诱导凋亡和减弱侵袭等作用。

表没食子儿茶素没食子酸酯;宫颈癌;血管内皮生长因子

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:961～963)

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶中含量最高，活性最强的单体［1］，研究显示，EGCG具有显著的清除氧自由基、抗氧化、抗衰老、防紫外线及预防心血管疾病等功效［2］。近年来，EGCG的抗肿瘤作用逐渐引起了人们的重视，EGCG可通过多种途径对肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和鼻咽癌等产生杀伤作用，有望开发成一种抗肿瘤新药［3］，有关EGCG对宫颈癌的作用目前报道较少，本文对此进行了研究。

1 材料与方法

1．1 药物试剂与仪器

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、噻唑喃(MTT)、碘化丙啶(PI)为美国Sigma产品;Transwell小室购自美国Costar公司;VEGF鼠抗人单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品;Mod 550型全自动酶标仪为美国Bio－Rad公司产品;Epics Elite ESP型流式细胞仪为美国Coulter公司产品。

1．2 CCK－8法检测细胞增殖

人宫颈癌HeLa细胞株由本院临床医学研究所提供，培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基内，于37℃、饱和湿度，5%CO2条件下培养，每2～3 d用0．25%胰酶消化，1∶2传代，取指数生长期HeLa细胞，以1×104个/ml接种于96孔板，培养24 h后吸出原培养液，加入含不同浓度EGCG的RPMI 1640培养基，使每孔终浓度分别为0、5、10、20、40、80、160 mg/ L，每组设5个复孔，继续培养24、48、72 h后，吸去上清液，每孔加入5 mg/ml MTT试剂10 μl，作用2 h后弃去上清液，150 μl二甲基亚砜作用30 min，在570

nm波长下读取各孔吸光度A值，计算细胞抑制率。细胞抑制率=(对照组吸光度－药物组吸光度)/对照组吸光度×100%。

1．3 流式法检测细胞周期及凋亡

收集经0、5、10、20、40 mg/LEGCG处理48 h的各组细胞，0．01 mol/L PBS0．5 ml重悬细胞，加70%乙醇1 ml，－20℃固定24 h，加入PI(终浓度为50 μl/ml)和RNA酶(终浓度为0．25 mg/ml)，室温下避光孵育30 min后流式细胞仪作DNA分析，以ModFit LT软件分析，拟合计算各时相细胞百分比。

1．4 细胞迁移检测［4］

［4］将细胞接种于培养板中24 h后去除培养液，用10 μl移液器枪头沿培养孔底部轻划一条划痕，用无血清培养液洗涤后更换含1%胎牛血清的培养液培养24 h，再换含10%胎牛血清的培养液继续培养24 h，显微镜下观察划痕区细胞的迁移情况。

1．5 Transwell法检测细胞侵袭性改变

细胞分组及处理同1．3，以NIH3T3细胞培养液做趋化液，在Transwell上室内加入100 μl不含小牛血清的RPMI 1640，37℃孵育1 h，加入上述各组细胞悬液20 μl(调细胞浓度为1．0×105个/ml)，每组4个复孔。37℃12 h后取出滤膜，甲醇固定，HE染色。显微镜下计数滤膜外表面的细胞数，每张滤膜随机取5个视野(×200)取均值，相对侵袭抑制率(%)=(对照组－实验组)/对照组×100%。

1．6 免疫印迹法检测VEGF蛋白表达

细胞分组及处理同1．3，消化收集细胞，PBS洗2次，裂解，离心，收集上清，即为细胞总蛋白，进行蛋白定量，调节每份样品蛋白浓度，加等量蛋白于上样缓冲液，煮沸，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后转膜，依次加入VEGF蛋白一抗和二抗，加入底物液显色，拍照。蛋白条带用Quanti Scan软件进行密度扫描分析。

1．7 统计学处理

采用SPSS 17．0软件进行统计学处理，数据采用±s表示。组间数据分析采用单因素方差分析(oneway ANOVA)，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 EGCG对细胞增殖的抑制作用

0～160 mg/L等7个浓度的EGCG分别作用于体外培养的HeLa细胞24、48、72 h，可对细胞增殖产生明显的抑制作用，呈现出一定的时间和剂量依赖关系。作用24、48、72 h的半数抑制浓度IC50分别为130．2、 33．4、21．7 mg/L(图1)。

图1 EGCG对HeLa细胞增殖的影响

2．2 EGCG对细胞周期分布、凋亡率的影响

在2．1筛选结果基础上，采用0、10、20、40 mg/L EGCG处理HeLa细胞48 h用于检测细胞凋亡及周期分布改变，结果显示，未经药物处理的空白对照细胞凋亡率很低，仅为(0．7±0．1)%，经上述浓度EGCG作用48 h，细胞凋亡率则明显升高，与对照组比较，均有显著性差异(P＜0．05，P＜0．01)。细胞周期分析结果显示，EGCG能够增加G1期细胞比例，降低S期细胞比例，EGCG剂量越大上述效果越明显(P＜0．05，P＜0．01)，说明EGCG可通过阻滞HeLa细胞于G1期诱导细胞凋亡(表1)。

表1 EGCG对HeLa细胞凋亡及周期分布的影响(±s，%，n=4)

表1 EGCG对HeLa细胞凋亡及周期分布的影响(±s，%，n=4)

与对照组比较，*为P＜0．05，＊＊为P＜0．01。

EGCG/mg·L－1凋亡率G1S M 6．2±1．3 00．7±0．145．1±2．243．2±1．17．7±1．1 102．9±0．2*50．5±2．1*41．3±1．89．7±1．3 2010．1±0．6*54．8±1．7*39．6±2．15．4±0．5 4018．2±1．8＊＊59．3±2．4*33．8±2．7*

2．3 EGCG对细胞迁移及侵袭的影响

接种培养板48 h后荧光显微镜下可见，与未经药物处理组比较，经5、10、20、40 mg/L EGCG作用后的HeLa细胞进入划痕区的数目明显减少，EGCG浓度越高上述现象越明显。细胞侵袭实验也显示出相似的作用结果，EGCG作用后的实验组细胞侵袭人工基底膜后，不仅在细胞数量上明显低于空白对照组，而且还表现出形态各异的伪足(表2)。

2．4 EGCG对细胞VEGF蛋白表达的影响

免疫印迹及灰度扫描结果显示，未经处理的空白对照HeLa细胞内VEGF蛋白呈高表达(灰度值为1．073±0．26)。经5、10、20、40 mg/L EGCG作用48 h

后，细胞内VEGF蛋白灰度值分别降至(0．901± 0．03)、(0．351±0．03)、(0．232±0．02)和(0．103± 0．02)，下调率分别为(14．7±2．1)%、(50．3± 2．1)%、(77．3±3．2)%和(88．5±2．3)%，与空白对照组比较，除5 mg/L EGCG下调效果未达到统计学差异外(P＞0．05)，其余组均具有显著性差异(图2)。

表2 EGCG对HeLa细胞迁移及侵袭的影响(±s，n=4)

表2 EGCG对HeLa细胞迁移及侵袭的影响(±s，n=4)

与对照组比较，*为P＜0．05，＊＊为P＜0．01。

EGCG(mg/L)细胞数目抑制率/% 0 162±20*18．5±2．1*10117±15＊＊36．1±3．7＊＊2086±11＊＊48．2±4．1＊＊4063±7＊＊61．5±3．3 210±16 5＊＊

图2 EGCG对HeLa细胞VEGF蛋白表达的影响

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，近年来其发病呈年轻化的趋势。失控性增殖和凋亡受阻是包括宫颈癌在内的恶性肿瘤的重要特征，而许多抗肿瘤药物也正是通过抑制肿瘤细胞增殖和(或)诱导肿瘤细胞凋亡产生作用。我们将绿茶中的主要成份EGCG作用于体外培养的宫颈癌HeLa细胞株，采用MTT法检测了其对细胞增殖的影响，结果发现，EGCG可明显抑制细胞增殖，且呈一定的时间和剂量效应关系。采用流式细胞仪做DNA倍体分析发现，经10、20、40 mg/L EGCG作用48 h，宫颈癌细胞凋亡率随药物浓度加大而增加，S期细胞数量显著减少，细胞周期被明显阻滞于G1期，这与宋岩岩等［5］采用形态学检测等方法在宫颈癌和其他肿瘤细胞上观察的EGCG作用结果相一致［6］，推测原因可能是由于细胞增殖的速度主要取决于细胞周期的长短，而细胞周期的长短又主要取决于G1期，EGCG通过阻滞细胞于G1期从而使细胞增殖周期延长，导致部分细胞出现凋亡［7］。

具有局部浸润和远处转移是恶性肿瘤另一重要的特征，也是恶性肿瘤致人死亡的主要原因，是恶性肿瘤的另一重要生物学行为。我们分别采用细胞划痕法和Transwell法对细胞侵袭能力进行检测，结果显示经EGCG作用后的宫颈癌细胞侵袭转移能力也明显受到抑制，表现为经EGCG作用后的肿瘤细胞进入划痕区和穿过基底膜的能力大大下降，数量明显减少。

VEGF是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子(heparin－binding growth factor)，可在体内诱导血管新生，是肿瘤生长、侵袭和转移的重要细胞因子。大量研究表明［8－9］，在包括宫颈癌在内的多种肿瘤细胞中，VEGF的过表达与肿瘤细胞的凋亡抵抗、侵袭转移及对化疗药物的多药耐药等有关。本研究显示EGCG还可明显下调VEGF的表达，说明EGCG对宫颈癌细胞产生的抑制增殖、诱导凋亡、降低侵袭和转移等作用与下调细胞内VEGF蛋白有关。但由于EGCG是1种多靶点的抑制剂，其对宫颈癌细胞的作用机制及靶点还远未阐明，尚需进行深入研究。

参考文献

［1］Ahmad N，Feyes DK，Nieminen AL，et al．Green tea constituent epigal－locatechin－3－gallate and induction of apoptosis and cell cycle arrest in human carcinoma cells〔J〕．Natl Cancer Inst，1997，89(24):1881－1885．

［2］温旭烨，李记英，蒋洁琳，等．表没食子儿茶素没食子酸酯的抗癌机制的研究进展〔J〕．食品工业科技，2013，34 (5):347－349．

［3］李彬彬，黄培春，黄国良，等．EGCG对鼻咽癌细胞增殖、凋亡及E2F－1表达的影响〔J〕．肿瘤防治研究，2012，39 (12):1407－1410．

［4］孙红村，郭明丽，王俊阁，等．稳定转染重组信号转导及转录激活因子3对喉癌Hep－2细胞侵袭性的影响〔J〕．中国眼耳鼻喉科杂志，2013，13(2):105－108．

［5］宋岩岩，谢亮群，史小林．表没食子儿茶素没食子酸酯对人宫颈癌细胞生长抑制作用及作用途径的探讨〔J〕．中华临床医师杂志(电子版)，2011，5(12):3503－3508．

［6］张春霞，王水明，金黑鹰，等．表没食子儿茶素没食子酸酯对结肠癌细胞株抑制作用的体外研究〔J〕．时珍国医国药，2012，23(4):833－836．

［7］邓守恒，曹凤军，蔡晓军，等．硒化壳聚糖诱导人早幼粒白血病细胞凋亡的研究〔J〕．时珍国医国药，2010，21(5): 1178－1179．

［8］韩海萍，赫莉，武川君，等．喉癌Gli1的表达及其与VEGF表达关系的研究〔J〕．中国美容医学，2012，21 (16):37－38．

［9］Su R，Li Z，Li H，et al．Grp78 promotes the invasion of hepato－cellular carcinoma〔J〕．BMC Cancer，2010，10:20．

Effect of EGCG on Proliferation、Invasion and VEGF Expression of Human Cervical Carcinoma HeLa Cells

CHEN Ping，DENG Shouheng．People＇s Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine，Shiyan，442000

ObjectiveTo study the effect of epigallocatechin－3－gallate(EGCG)on proliferation，apoptosis and invasion of human cervical carcinoma HeLa cells，and its mechanism．MethodsThe effect of EGCG on proliferation of HeLa cells was detected by MTT method and．Cell apoptosis and cell cycle were detected by the flow cytometry．Cell invasive ability was measured by cell scratch assay and Transwell method．The expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)was detected by western blot．ResultsEGCG could inhibit cell proliferation and invasion，and increase cell apoptosis of HeLa cells in a dose－dependent manner and the level of VEGF was markedly suppressed by EGCG．ConclusionEGCG can suppress the proliferation，induce apoptosis and decrease invasion of HeLa cells by down－regulating the expression of VEGF．

Epigallocatechin－3－gallate(EGCG);Cervical carcinoma;Vascular endothelial growth factor(VEGF)

10．3969/j．issn．1001－5930．2015．07．004

R737．33

:A

:1001－5930(2015)07－0961－03

2014－10－10

2015－02－26)

(编辑:吴小红)

湖北省教育厅项目(编号:B20122413)

442000湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心

邓守恒