1株嗜盐细菌ZSTB203的鉴定及其生长特性研究

汪雪婷，杨丹丹，陈　敏

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

1株嗜盐细菌ZSTB203的鉴定及其生长特性研究

汪雪婷，杨丹丹，陈敏

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

摘要：采用形态学观察、生理生化反应和16S rRNA基因序列同源性分析方法，对嗜盐菌株ZSTB203进行鉴定，并对其生长特性进行研究.结果表明，ZSTB203菌株呈杆状，革兰氏染色阳性，具有芽孢，不含类脂粒.16S rRNA基因测序结果显示，该菌株与Halobacillus faecis NBRC103569的相似度达99.7%.进一步结合生理生化反应试验，将ZSTB203鉴定为喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)的成员.ZSTB203菌株的最适生长温度为30 ℃，最适生长pH 7.0，10% NaCl，生长需氧.

关键词：嗜盐细菌；鉴定；生长特性

嗜盐菌 (Halophiles) 是指在高盐条件中生长的一类微生物，广泛分布于盐湖、盐碱湖、死海、盐场等浓缩海水，以及腌鱼、咸肉等盐制品中[1].目前，有关嗜盐菌的研究主要涉及生理生态和分类学，嗜盐菌的工业化应用如发酵食品、酶、多聚化物、相容性溶质、有毒物质的降解等[1-5].另外，嗜盐菌因其具有广泛的盐适应能力及特殊的生理特性和代谢机制，成为人们分离筛选新的活性物质的重要来源[6].据报道，嗜盐细菌可以产生嗜盐菌素、抗生素、胞外多糖和各种活性酶等[3].Iizuka等分离得到一株弱嗜盐的海洋粘细菌 SMH-27-4，可以产生新颖的缩肽类抗生素 miuraenamides A-B，对植物病原菌(疫霉属)有选择性抑制活性[7].Yang等从中国黄海的沉积物中分离得到一株嗜盐细菌HalobacilluslitoralisYS3106，从其发酵产物中分离得到3个新的环肽 halolitoralin A-C，具有抗真菌作用[8].

嗜盐细菌ZSTB203分离自舟山市岱山盐田表层土壤，经前期研究结果表明，该菌株对多种致病细菌和真菌具有拮抗作用(研究结果另文报道)，是一株具有广谱抗菌活性的菌株.本研究通过形态、生理生化和16S rRNA基因测序，对ZSTB203菌株进行鉴定，同时对其生长特性进行初步研究，以期为进一步开发新型生物活性物质提供理论依据.

1材料与方法

1.1　菌种

ZSTB203菌株：分离自舟山市岱山盐博物馆(30°14′N，122°11′E)周边盐田表层土壤，本研究室保藏.

1.2　培养基

RM培养基：硫酸镁七水 20.0 g·L-1，柠檬酸钠 3.0 g·L-1，氯化钾 2.0 g·L-1，无水氯化钙 0.2 g·L-1，细菌蛋白胨 10.0 g·L-1，氯化钠 100.0 g·L-1，pH 7.0，固体培养基加琼脂粉15.0 g·L-1，半固体培养基加琼脂粉5.0 g·L-1.

LB培养基：胰蛋白胨 10.0 g·L-1，酵母提取物 5.0 g·L-1，氯化钠 10.0 g·L-1，pH 7.0~7.4，固体培养基加琼脂粉15.0 g·L-1.

1.3　主要试剂及仪器

PCR仪系BIO-RAD公司(PE-9600)；凝胶成像系统及成像软件Gene Snap 3.0 系Syn Gene 公司；细菌基因组DNA 提取和纯化试剂盒(生工生物公司SK8226)、PCR 常规操作用试剂和16S rRNA 基因PCR扩增所用酶均购自Takara公司.

1.4　菌株的鉴定

1.4.1形态学鉴定

取试管斜面保藏的菌种在RM固体平板培养基上划线，37 ℃恒温培养，待菌体长成后观察平板上单菌落的形态特征.菌体细胞的单染色、革兰氏染色、芽孢染色、类脂粒(PHB)颗粒检测等参照文献[9].

1.4.216S rRNA基因检测

采用细菌基因组提取试剂盒方法提取菌体DNA，采用细菌通用引物(P0：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和P6：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)进行PCR，PCR反应条件参见文献[10].测序由上海英潍捷基生物公司完成.

1.4.3系统发育树的构建及分析

测序结果提交到GenBank得到基因序列登录号.根据测序结果，用Blast搜索软件从GenBank、EMBL 和DDBJ等公共数据库中调出相似性较高的相关菌株的16S rRNA 基因序列，并用MEGA 5.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis )软件构建系统发育进化树[11].

1.4.4生理生化鉴定

生理生化反应鉴定参见文献[12].

1.5　生长特性

1.5.1种子液制备

将斜面菌种接入RM液体培养基中，37 ℃、200 r/min 摇床培养24 h，分光光度计600 nm下测光密度值在1.5以上可作为种子液使用.

1.5.2生长量测定

将种子液以5%接种量接入装有50 mL RM培养基的三角烧瓶中，37 ℃、200 r/min 摇床培养36 h后，分光光度计600 nm下测定光密度值.

1.5.3NaCl的需求及耐受性

分别设置培养基NaCl质量分数为0%、5%、10%、15%、20%、25%和30%，200 r/min培养36 h后测光密度值，每组试验设置3个重复.

1.5.4生长pH范围

分别设置培养基pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，200 r/min 培养36 h后测光密度值，每组试验设置3个重复.

1.5.5生长温度范围

培养温度分别设置为25、30、35、40和45 ℃，200 r/min 培养36 h后测光密度值，每组试验设置3个重复.

1.5.6氧气的需求

用250 mL三角瓶分别装料20、30、50、70和100 mL，200 r/min培养36 h后测光密度值，每组试验设置3个重复.

1.5.7生长曲线测定

根据以上生长特性实验结果，设置适宜培养条件，每间隔3 h取样，600 nm下测定发酵液的光密度值，以培养时间为横坐标、光密度值为纵坐标，绘制生长曲线.

2结果与分析

2.1　菌株ZSTB203的鉴定

在RM固体培养基上，菌落颜色为乳白色，圆形，较大，直径约3 mm，边缘规则，上表面光滑，圆润有光泽，不透明，中间凸起(图1).显微镜下观察菌体呈杆状(图2)，直径大小(2.1±0.53)μm×(0.79±0.26)μm，革兰氏阳性，具有芽孢，芽孢中生，不膨大.不含类脂粒.

图1　ZSTB203菌株的菌落形态Fig. 1　Colony morphology of strain ZSTB203

图2　ZSTB203菌株的细胞形态Fig. 2　Cell morphology of strain ZSTB203

对ZSTB203菌株的16S rRNA基因序列进行扩增，将PCR产物进行序列测定，测序结果提交到GenBank，得到基因序列登录号为KJ792789.在NCBI中进行同源性比对，结果与喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)的16S rRNA序列自然聚类，在相似性最高的100个序列中喜盐芽孢杆菌属占92%，其中与HalobacillusfaecisNBRC103569的相似度最高为99.7%.从100个序列中挑取12个已知种的16S rRNA序列进行系统发育树的构建，由图3可知，ZSTB203菌株与HalobacillusfaecisIGA7-4(NR 041360.1) 及HalobacillusfaecisNBRC103569(NR 114247.1) 聚为一支，说明与它们都有较近的亲缘关系，分子鉴定结果，ZSTB203归于喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus).

图3　菌株ZSTB203及其近缘种构建的系统发育树Fig. 3　Phylogenetic tree showing the relationship between ZSTB203 and the type species in Halobacillus

ZSTB203菌株的生理生化鉴定结果如表1所示.结果表明，菌株ZSTB203与喜盐芽孢杆菌属成员的部分性状相同，如都具有芽孢、革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阳性、硝酸盐还原阴性、伏-普试验阴性、明胶水解阳性、苯丙氨酸脱氢酶阴性、精氨酸双水解酶阴性等.但同时也存在差异，如氧化酶：ZSTB203菌株是阴性，而其他喜盐芽孢杆菌是阳性；脲酶：ZSTB203菌株是阳性，其他喜盐芽孢杆菌是阴性.在糖发酵的各项指标上，ZSTB203菌株与Halobacillushalophilus一致，均为阴性反应，而其他喜盐芽孢杆菌多为阳性反应.综合形态学鉴定及16S rRNA基因测序，初步鉴定ZSTB203为喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)的成员.

表1　菌株ZSTB203与Halobacillus属成员表型特征的比较

NR：不确定.

2.2　ZSTB203菌株的生长特性

如图4所示，ZSTB203菌株在0%~20% NaCl时均可生长，但在10%NaCl时生长最好；生长pH范围7.0~10.0，其中pH7.0时生长最好；温度生长范围为25~45 ℃，以30 ℃时生长最好；生长需要氧气，在装液量为20~100 mL时均生长良好.

图4　ZSTB203菌株的生长特性Fig. 4　The growth property of strain ZSTB203

2.3　菌株ZSTB203的生长曲线

在以上最适培养条件下，菌株的生长曲线如图5所示.在培养9 h以后，菌株生长进入对数期；30 h时左右，菌株生长进入平稳期；66 h以后生长呈下降趋势.

3讨论

图5　菌株ZSTB203生长曲线Fig. 5　The growth curve of strain ZSTB203

细菌鉴定中最经典和最常用的指标主要包括形态、培养特征、生理生化反应、生态特征等.20世纪70年代以来，核糖体RNA(rRNA)，尤其是16S rRNA基因测序成为分子鉴定的主要内容，这是因为16S rRNA广泛存在于各种生物中，其生物功能十分重要并且恒定，片段大小适中，既有高度保守的序列区域又有中度保守和高度变化的序列区域，被认为是研究系统发育关系的最佳模板.

ZSTB203菌株的16S rRNA基因序列与喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)的同源性最高，与该属各菌株的同源性分布为97.0%～99.7%(NCBI).从生理生化反应结果来看，ZSTB203菌株与喜盐芽孢杆菌属各模式菌株[13]有很多特征是一致的，如产过氧化氢酶阳性、硝酸还原阴性、V-P试验阴性、能水解明胶、不能水解吐温80、卵磷脂酶阴性、苯丙氨酸脱氢酶阴性、精氨酸双水解酶阴性等.但也有不同之处，如葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、木聚糖、甘露醇、海藻糖等的发酵利用.这些差异可能和菌株筛选地点的环境不同有关.

总之，从形态学、生理生化以及16S rRNA基因序列分析可以看出，ZSTB203菌株与喜盐芽孢杆菌属各模式菌株紧密相关，具有很大的相似性，但也有一些不同之处.因此，若要将该菌株鉴定到种，还需要借助全细胞脂肪酸分析、呼吸醌类型、DNA G+C mol%含量和DNA-DNA杂交等多相分类学鉴定技术，这有待于后续研究来完成.

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Identification and Growth Characteristics of a Halophilic Bacterium ZSTB203

WANG Xueting, YANG Dandan, CHEN Min

(College of Life and Environmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Abstract:The identification of the strain ZSTB203 is determined by morphological characteristics, physiological tests and homology analysis based on 16S rRNA gene sequence comparison. The results show that ZSTB203 strain is Gram-positive, rod in shape, containing spores and no lipid particles. 16S rRNA gene sequence analysis showes that the strain is closely related to the member of Halobacillus faecis NBRC103569, with which they share 99.7% similarity. The optimum condition for ZSTB203 growth is NaCl 10%, temperature 30 ℃ and pH 7.0.

Key words:Halophilic bacteria; identification; growth property

文章编号:1674-232X(2015)06-0596-06

中图分类号:Q938

文献标志码:A

doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2015.06.008

通信作者：陈敏(1963—)，女，教授，主要从事微生物学研究.E-mail:mchen63@163.com

基金项目：浙江省自然科学基金项目(LY14C010004).

收稿日期：2015-01-07