人附睾蛋白4在乳腺癌发生发展中的机制研究

周岩，宋伟杰，张飞，冀为，田然，牛瑞芳，黎小沛

（1．天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，肿瘤研究所公共实验室，天津300060；2.天津医科大学基础医学院，天津300070）

论著

人附睾蛋白4在乳腺癌发生发展中的机制研究

周岩1，宋伟杰1，张飞1，冀为1，田然1，牛瑞芳1，黎小沛2

（1．天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，肿瘤研究所公共实验室，天津300060；2.天津医科大学基础医学院，天津300070）

目的：探讨人附睾蛋白4（HE4）在乳腺癌发生发展中的机制研究。方法：采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测15例原发乳腺癌组织及其配对的癌旁正常组织中HE4 mRNA的表达水平。RT-qPCR和Western blot检测常见乳腺（癌）细胞系中HE4 mRNA和蛋白表达水平。通过RNA干扰技术沉默HE4高表达的乳腺癌SKBR3细胞中HE4表达，通过CCK8和克隆形成实验分析沉默HE4表达对SKBR3细胞增殖的影响。流式细胞术检测沉默HE4表达对SKBR3细胞凋亡的影响。Western blot检测沉默HE4表达对Erk和Akt磷酸化水平的影响。结果：HE4 mRNA在乳腺癌组织中高表达；沉默HE4表达抑制乳腺癌细胞SKBR3细胞增殖能力并促进其凋亡，Erk和Akt蛋白磷酸化水平降低。结论：HE4通过影响Erk和Akt信号通路促进乳腺癌发生发展。

人附睾蛋白4；乳腺癌；增殖；凋亡

乳腺癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤，其发病率及死亡率在我国均呈上升趋势。乳腺癌的发生发展是一个多基因参与的复杂的演变过程，其病因及机制尚未完全阐明。因此，研究乳腺癌发生发展的分子机制是建立其早期诊断和治疗的重要途径，对提高患者生存具有重要意义。人附睾蛋白4（human epididymis protein 4，HE4），其编码基因位于20q12～13q.1，编码124个氨基酸的HE4蛋白前体。该蛋白含有由8个半胱氨酸和4个二硫键组成的，高度保守的WAP（Whey Acidic Protein）结构域。目前关于HE4的研究集中在卵巢癌的早期筛查、诊断和预后评价，其在乳腺癌中的作用鲜有报道。本研究探讨HE4在乳腺癌组织中的表达情况及其与乳腺癌发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集天津医科大学肿瘤医院2005年2月-2006年8月原发乳腺癌组织及配对的癌旁正常组织各15例。均为术中立即取材，组织标本立即冻存于-80℃冰箱中。

1.1.2 试剂 Lipofectamine 2000、cDNA SuperScript II Reverse Transcriptase、Fast SYBR Green Master MixSystem、Trizol、RPMI-1640、DMEM/F12、胎牛血清、马血清等购于Life Technologies公司。HE4抗体购于Abcam公司，Erk、AKT、p-Erk和p-AKT抗体购于Cell Signaling公司，β-actin抗体购于Sigma公司。CCK8试剂盒购于Takara公司，HE4 siRNAs购于上海吉凯公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人乳腺上皮细胞MCF10A、乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231和SKBR3购于中国生命科学院上海细胞库。MCF10A细胞培养于含有5%马血清、10 μg/mL胰岛素、0.5 μg/mL氢化可的松、20 ng/mL EGF和100 ng/mL霍乱毒素的DMEM/ F12培养基中，MCF7、MDA-MB-231和SKBR3培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640中。所有培养基含有1%青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/ mL），于含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染 转染前一天将5×105个细胞接种于6孔板，无抗生素培养基培养，采用Lipofectamine 2000转染试剂，按说明书进行操作，转染后6 h换为新鲜培养基，进行后续实验。

1.2.3 RNA的提取 采用Trizol试剂提取组织标本或细胞总RNA，微量核酸定量分析仪测定浓度并进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。

1.2.4 逆转录荧光定量PCR 采用cDNASuperScript IIReverseTranscriptase反转录试剂盒将RNA逆转录为单链cDNA，荧光定量PCR采用Fast SYBR Green MasterMixSystem荧光定量PCR试剂盒，反应条件按照试剂盒说明书进行。β-actin作为管家基因。

1.2.5 Western blot 细胞转染后48 h加入适量裂解液，变性后取50 μg总蛋白，经10%SDS-PAGE转印至PVDF膜后，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入相应一抗，4℃孵育过夜，用PBS洗膜后加入相应二抗，室温孵育1 h，加入ECL曝光。

1.2.6 CCK8实验 将转染后的细胞接种于96孔板，培养相应时间后，加入10 μL CCK8溶液，继续培养4 h，450 nm处检测吸光度。

1.2.7 克隆形成 细胞转染24 h后制备成单细胞悬液，按每孔1000个细胞接种于6cm培养皿，每3d换1次培养液，培养3周后，用PBS漂洗，4%多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色15 min后，在显微镜下计数，每50个细胞以上记为一个克隆。

1.2.8 流式细胞术 细胞转染后48 h，收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入100 μL染料结合缓冲液重悬后，分别加入10μLFITC-AnnexinV和5μL PI（50 mg/L）染料，室温孵育15min，补加200μL结合缓冲液，静置5min后经流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.3 统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件，实验结果用均值±标准误表示，结果采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE4在乳腺癌组织和癌旁正常组织的表达水平 采用RT-qPCR检测了15例原发乳腺癌组织及配对的癌旁正常组织中HE4 mRNA的表达水平，结果显示较配对的癌旁正常组织，在80%（12/15）的样本中，原发乳腺癌组织HE4 mRNA表达上调（P< 0.001）（图1）。

图1 RT-qPCR检测原发乳腺癌组织及配对的癌旁正常组织中HE4 mRNA表达水平Fig 1 Detecting the expression level of HE4 mRNA in primary breast cancer tissues and the paired adjacent normal tissue

2.2 HE4在乳腺癌细胞系及乳腺上皮细胞系中表达水平 通过定量PCR检测正常乳腺细胞MCF10A和乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231和SKBR3中HE4 mRNA表达水平，结果显示HE4在正常细胞中低表达，在乳腺癌细胞系中呈高表达（图2A）。进一步通过Western blot检测HE4蛋白表达水平，结果显示HE4蛋白表达水平与mRNA结果一致，在MCF10A中低表达，MCF7、MDA-MB-231、SKBR3中高表达（图2B）。证实HE4在乳腺癌中是潜在的促癌基因。

图2 HE4在乳腺（癌）细胞系中表达水平Fig 2 The expression of HE4 in breast cancer cell line

2.3 siRNA对HE4表达水平的影响 细胞转染HE4 siRNAs 24 h后提取细胞总RNA，RT-qPCR显示实验组HE4 mRNA表达水平较对照下降约80%（图3A）。细胞转染48 h后提取细胞总蛋白，Western blot显示实验组HE4蛋白表达水平较对照组显著降低（图3B）。提示HE4 siRNAs能有效抑制SKBR3细胞中HE4表达。

图3 转染HE4 siRNAs后SKBR3细胞HE4的表达水平Fig 3 The expression of HE4 in transfected SKBR3 cell with siRNAs

2.4 HE4表达对乳腺癌细胞增殖的影响 结果显示，沉默HE4后细胞增殖能力显著降低（图4A）；沉默HE4表达的SKBR3细胞克隆个数显著减少（图4B）。提示沉默HE4表达能抑制乳腺癌细胞系SKBR3的细胞增殖能力。

图4 沉默HE4表达对乳腺癌细胞SKBR3增殖能力的影响Fig 4 Effect of silencing HE4 on SKBR3 cell proliferation

2.5 HE4表达对乳腺癌细胞凋亡及相关信号通路的影响 结果显示，沉默HE4表达的SKBR3细胞凋亡比例显著上调（10%～15%vs 5%；图5A）。沉默HE4表达后磷酸化的Erk和Akt表达下调（图5B），提示沉默HE4表达可通过抑制Erk和Akt信号通路，而导致乳腺癌细胞凋亡。

图5 沉默HE4表达对细胞凋亡及相关信号通路的影响Fig 5 Effect of silencing HE4 on cell apoptosis and signal pathway

3 讨论

人附睾蛋白4由5个外显子和4个内含子组成，并存在多种剪切方式[1]。目前关于HE4的生物学功能尚不清楚，其编码的小分子分泌型蛋白与细胞外蛋白酶抑制剂具有高度同源性，其是由乳清酸性蛋白（WAP-type fourdisulphide core protein，WFDC）基因编码的分泌型糖蛋白，但其是否同家族中的蛋白酶抑制因子一样具有抑制蛋白水解酶作用，还有待于进一步研究[2]。

HE4表达水平与多种肿瘤形成具有一定相关性，Galgano等[3]报道HE4在多种恶性肿瘤组织中高表达，如子宫内膜癌、胃癌、支气管肺（腺）癌、卵巢癌和乳腺癌等，且HE4表达水平与该肿瘤的发生发展存在相关性。通过RNA干扰技术沉默卵巢癌细胞中的HE4表达，结果显示沉默HE4表达的卵巢癌细胞发生G1期阻滞，且细胞增殖、运动和侵袭能力显著降低[4]。同时，外源表达HE4蛋白不仅能显著增强子宫内膜癌和卵巢癌的体外细胞增殖、侵袭能力，还明显促进了动物移植瘤的生长和转移[5-6]。近期研究也表明沉默HE4表达能抑制胃癌的进展，且HE4表达水平与胃癌、小细胞肺癌患者预后相关[7-8]。Hellstrom等[9]比较了卵巢癌患者及正常人血清中HE4蛋白的含量，结果显示多数卵巢癌患者血清中HE4蛋白高表达，但关于HE4在乳腺癌中的表达状态及生物学作用还鲜有报道，本研究证实HE4在乳腺癌组织中高表达。进一步通过RNA干扰技术发现，沉默HE4表达的乳腺癌细胞SKBR3体外增殖能力显著降低，凋亡能力显著增强。因此，HE4蛋白的异常表达可能在多种肿瘤的演变过程中发挥着重要的作用。

然而，HE4参与肿瘤形成的具体信号通路目前仍不清楚，初步研究显示可能与其激活NF-κB和EGFR-MAPK信号通路有关[10-11]。本研究证实，沉默HE4表达后，磷酸化的Erk和Akt水平显著降低，而Erk和Akt在细胞增殖和凋亡中发挥着重要的作用[12]。提示HE4可能通过调控Erk和Akt参与乳腺癌的增殖和凋亡，其内在的分子机制尚需进一步阐明。

综上，HE4作为一种新的肿瘤标志物正在引起越来越多研究者的关注，在肿瘤发生、发展和患者预后预测方面的作用在不断被发现，但有关其在肿瘤中的作用机制还研究甚少，其与乳腺癌发生、发展和转移的关系尚需进一步讨论。

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（2015-03-12收稿）

Action mechanism of human epididymis protein 4 in development and progression of breast cancer

ZHOU Yan1,SONG Wei-jie1,ZHANG Fei1,JI Wei1,TIAN Ran1,NIU Rui-fang1,LI Xiao-pei2
（1．Department of Public Laboratory,Cancer Institute and Hospital,Tianjin Medical University,National Clinical Research Center for Cancer，Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China;2.Basic Medical College,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China）

Objective：To explore the mechanism of human epididymis protein 4（HE4）in development and progression of breast cancer.Methods：Reverse transcription quantitative PCR（RT-qPCR）was used to detect the HE4 mRNA expression levels in primary breast cancer tissues and the paired adjacent normal tissues.The HE4 mRNA and protein expression was also detected in breast epithelial cell lines by RT-qPCR and western blot,respectively.The RNAi was used to knock down the HE4 expression in HE4 high expression level cell line SKBR3,CCK8 and colony formation assays were performed to analyze the proliferation ability.Flow cytometry was applied to detect the apoptotic cells in HE4-depleted cells.The phosphorylation expression levels of Erk and Akt was evaluated by western blot.Results：The HE4 mRNA was up-regulated in primary breast cancer tissues compared with the adjacent normal breast tissues.Depletion of HE4 expression suppressed the proliferation and promoted the apoptosis in SKBR3 breast cancer cell line.Furthermore,the phosphorylation expression levels of Erk and Akt were reduced in HE4-depleted SKBR3 cells.Conclusion：HE4 promotes breast cancer development and progression through Erk and Akt signaling.

human epididymis protein 4;breast cancer；proliferation;apoptosis

R737.9

A

1006－8147（2015）06-0466-03

天津市应用基础及前沿技术研究计划项目基金资助（10JCYBJC14400）

周岩（1985-），女，硕士在读，研究方向：生物医学工程；通信作者：黎小沛，E-mail：xpli@tijmu.edu.cn。