利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株

刘郁莹，崔晓腾，高星杰，赵秀娟，付雪，葛林，苏超，杨洁,

（天津医科大学1.生物化学系；2.基础医学研究中心；3.细胞生物学系，天津 300070）

论著

利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株

刘郁莹1，崔晓腾1，高星杰2，赵秀娟3，付雪1，葛林1，苏超2，杨洁1,2

（天津医科大学1.生物化学系；2.基础医学研究中心；3.细胞生物学系，天津 300070）

目的：利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除HeLa细胞中SND1基因，构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。方法：设计一对特异性识别SND1基因第二个启动子的上下游sgRNA，以PX462质粒为载体，构建出一对重组真核表达质粒。酶切和测序鉴定后，将一对重组质粒共同转染进入HeLa细胞中，使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选，挑取单克隆细胞进行培养。最后用Western Blot鉴定敲除效果。结果：sgRNA正确插入到PX462质粒载体中，转染并筛选单克隆后的细胞中没有SND1蛋白的表达。结论：成功构建出HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。

SND1；基因敲除；CRISPR/Cas9；HeLa细胞

人类SND1（Staphylococcal Nuclease Domain-Containing Protein 1）蛋白是在不同种属间具有高度保守性的蛋白质[1-4]，广泛参与细胞多种生物学过程[5-8]。本实验是利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统，即以一对单链向导RNA（single guide-RNA, sgRNA）靶标SND1基因，招募Cas9核酸酶的突变体Cas9n核酸切口酶（Cas9 D10 nickase,Cas9n）对其进行切割，从而敲除SND1基因，构建出HeLa细胞SND1基因敲除稳定株，为更加深入地研究SND1蛋白的功能提供了一个SND1基因敲除的人类细胞模型。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 HeLa细胞为本实验室留存；真核表达质粒pSpCas9n（BB）-2A-Puro（PX462）由天津医科大学吴旭东教授惠赠；trans1-T1感受态细胞、Trans2K PlusII DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶BbsI、DMEM高糖培养基购自Thermo公司；T4连接酶购自NEB公司；质粒保护的核酸外切酶（plasmid safe exonuclease）购自Epicentre公司；去内毒素质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Biomiga公司；Neofect转染试剂购自零客创智生物科技有限公司；BCA蛋白测定试剂盒购自Pierce公司；鼠源SND1蛋白抗体为本实验室自制[9]；β-tubulin蛋白抗体购自Sigma公司；辣根过氧化物酶标记的抗鼠源IgG二抗购自Fermentas公司；LumiGLo化学发光底物购于KPL公司；RIPA裂解液、嘌呤霉素（puromycin）购自北京索莱宝科技有限公司。CO2培养箱购自Thermo公司；Western blot电泳槽、电泳仪购自Bio-Rad公司。sgRNA序列合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成；质粒测序由北京天一辉远生物科技有限公司完成。

1.2 实验方法

1.2.1 针对SND1基因序列的sgRNA设计 （1）采用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/网站确定人类SND1（NM_014390.2）的基因序列。（2）根据文献提示[10]，使用 http：//crispr.mit.edu/设计 SND1基因 double nick的上下游sgRNA。sgRNA设计原则：（1）sgRNA的5′端第一个碱基若不是G，则需要在前面加上1个G；（2）以sgRNA序列为模版，设计出其互补链；（3）sgRNA及其互补链分别添加BbsI的酶切位点。

1.2.2 重组真核表达质粒PX462-sgRNA的构建 （1）PX462载体线性化：使用快速限制性内切酶BbsI线性化PX462质粒载体，切胶回收。体系：1 μg PX462载体，1 μL BbsI，1 μL FastAP，2 μL 10×Green FastDigest Buffer，加水稀释至20 μL。程序：37℃，30 min；4℃，stop。（2）sgRNA的合成及形成二聚体：人工合成sgRNA寡核苷酸链A、B及其互补链，使用降落PCR退火形成二聚体。体系：100 nmol sgRNA-A/B，100 nmol sgRNA-A/B的互补链，1 μL 10×T4 Ligation Buffer，0.5 μL T4 PNK，加水至10 μL。程序：37℃，30 min；95℃，5 min；-1℃/min，至25℃；4℃，stop。（3）sgRNA二聚体与PX462线性载体连接：PX462载体和降落PCR产物比例为1∶3，室温（25℃）反应60min。体系：PX462线性载体50ng，降落PCR产物150 ng，1 μL 10×T4 Ligation Buffer，加水稀释至10 μL，1 μL T4 Ligase。程序：25℃，60 min；4℃，stop。（4）重组质粒纯化：使用质粒保护的核酸外切酶去除非特异连接。体系：11μL二聚体与载体连接后的产物，1.5 μL 10×PlasmidSafe Buffer，1.5 μL 10mmolATP,1μLPlasmidSafeexonuclease。程序：37℃，30 min；4℃，stop。（5）转化trans1-T1感受态细胞，挑取单克隆摇菌，使用去内毒素质粒小提试剂盒提取质粒，进行酶切和测序验证。

1.2.3 重组真核表达质粒的酶切鉴定 使用快速限制性内切酶BbsI对PX462质粒载体、PX462-sgRNA-A、PX462-sgRNA-B进行酶切。体系：1 μg质 粒 ，1 μL BbsI，1μL FastAP，2 μL 10×Green FastDigest Buffer，加水稀释至20 μL。程序：37℃，30 min；4℃，stop。酶切后，使用1%的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。

1.2.4 HeLa细胞培养及转染 以去内毒素质粒提取试剂盒提取无内毒素质粒载体PX462和重组真核表达质粒PX462-sgRNA-A、PX462-sgRNA-B。 HeLa细胞接种至6 cm皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养,至细胞50%～60%汇合时，根据产品说明书使用Neofect转染试剂瞬时转染质粒载体PX462（HeLa-SND1-WT）或共转重组真核表达质粒PX462-sgRNA-A和 PX462-sgRNA-B（HeLa-SND1-KO）。

1.2.5 HeLa细胞SND1基因敲除稳定株的单克隆筛选 转染后48 h，更换培基为含有2 μg/mL Purom ycin和10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，以未转染的HeLa细胞为阴性对照。加药48 h后，未转染的HeLa细胞全部被杀死。72 h后撤去培基中的Puromycin继续培养。待细胞长满，将细胞用胰酶消化，铺到10 cm皿中，平均每个显微镜低倍镜视野中有3～5个细胞即可。待细胞长成单克隆集落，用枪头分别将单克隆集落轻轻刮取，移至96孔板中培养。待96孔板长满，移至24孔板中继续培养。1.2.6 HeLa细胞SND1基因敲除稳定株Western Blot检测 将筛选后的单克隆稳定株HeLa-SND1-WT和HeLa-SND1-KO分别传至6 cm皿中培养。待细胞长满，使用预冷的PBS缓冲液对细胞洗涤3次，吸净PBS后，加入300μL RIPA裂解液，用干净的细胞刮刮取细胞至1.5 mL离心管中，冰上静置裂解15 min。之后对其进行超声处理，强度60%，时间30 s（1次10 s，间隔5 s，共进行3次）。4℃13 000 r/min超速离心10 min，取上清细胞裂解液。用BCA蛋白测定试剂盒测定裂解液的蛋白浓度后，加入5×上样缓冲液（50%甘油，10%SDS，0.5%溴酚蓝，250 mmol pH6.8 Tris-HCl），99℃对其热变性10 min。进行8% SDS-PAGE电泳后，用湿电转膜仪将PAGE胶上蛋白质转移到0.45 μm PVDF上。使用含有5%脱脂牛奶的TBST溶液封闭2 h后，用自制鼠源SND1抗体4℃孵育过夜。使用TBST溶液洗涤PVDF膜3次，每次10 min。用辣根过氧化物酶标记的抗鼠源IgG二抗室温孵育2 h。之后再用TBST溶液洗涤PVDF膜3次，每次10 min。孵育LumiGLo化学发光底物1 min，进入暗室曝光。

2 结果

2.1 sgRNA靶点的选择及寡核苷酸链的设计 由于SND1基因第1个外显子区（expressed region 1, EXON 1）和基因编码区（Coding Sequence,CDS）的重叠区域过短，因此选取第2个外显子区进行sgRNA设计。CRISPR/Cas9系统工作示意图如图1。设计好的sgRNA及其互补链如表1。

图1 CRISPR/Cas9系统切割SND1基因外显子上下游Fig 1 CRISPR/Cas9 system cut the upstream and downstream of SND1

表1 上下游sgRNA及其互补链寡核苷酸序列Tab 1 The nucleotide sequences of the upstream and downstreamsgRNA

2.2 重组真核表达质粒PX462-sgRNA的酶切和测序结果 利用BbsI限制性内切酶对构建好的PX462-sgRNA-A和PX462-sgRNA-B进行酶切。结果如图2 A，成功构建的质粒不含有BbsI酶切位点，因此不能被切割为线性。测序结果如图2 B，插入序列的位置、方向均正确，质粒构建成功。

图2 重组真核表达质粒的酶切和测序结果Fig 2 The enzyme digestion and sequencing of recombinant eukaryotic expressional plasmid

2.3 Western blot检测HeLa细胞SND1基因敲除稳定株中SND1蛋白的表达 结果如图3，同HeLa-SND1-WT相比，HeLa-SND1-KO中的SND1没有表达，HeLa细胞SND1基因敲除稳定株构建成功。

图3 单克隆稳定株Western blotFig 3 Western blotting of monoclonal stable strain

3 讨论

SND1蛋白序列在不同生物中具有高度的保守性，参与调控细胞多种重要的生理过程。有研究表明，SND1蛋白在肿瘤迁移中也有作用[11]。因此，建立稳定敲除SND1蛋白的细胞株有助于研究其生理病理条件下的功能。

本实验中，我们利用CRISPR/Cas9系统来完成对HeLa细胞中SND1基因的靶向性敲除。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences,CRISPR）序列本是细菌抵御病毒入侵的防御机制，近年来科学家对其进行改造，成为基因编辑的又一有力武器。传统CRISPR/Cas9系统是以sgRNA为向导，靶标目的基因，招募Cas9核酸酶对DNA双链进行切割，从而敲除该基因[12]。对比 ZFN（Zinc-finger nucleases） 技术和 TALEN（transcription activator-like effector nucleases）技术，此方法简便易行，成为靶向基因编辑的重要技术。但是由于sgRNA长度的局限，传统CRISPR/Cas9系统容易产生脱靶效应，即sgRNA识别到其他基因处，导致其他基因敲除。麻省理工学院的Zhang等[13]对其进行改良，将Cas9核酸酶的RuvC结构域中的天冬氨酸突变成丙氨酸（D10A），导致RuvC结构域失去活性，突变后的Cas9酶变成Cas9n核酸切口酶，只能切割单链。如果DNA只被一个Cas9n切割，产生单链缺口，细胞很快利用碱基切除修复途径进行DNA修复。因此使用一对sgRNA对目的基因上下游进行靶标并招募Cas9n进行切割，导致细胞利用非同源性末端接合（non-homologous end joining,NHEJ）机制进行DNA修复。此修复机制并不精确，易产生框移突变，从而达到敲除目的基因的作用。

实验中，我们选择PX462质粒作为载体，该质粒可以同时表达Cas9n和插入的sgRNA，简化了表达Cas9n质粒和sgRNA质粒共转染的步骤。转染后，使用2 μg/mL Puromycin进行阳性细胞筛选。同时使用未转染的HeLa细胞作为对照，也加入2 μg/mL Puromycin，待该细胞全部杀死时，即认为转染组存活下来的细胞为带有Puromycin抗性的阳性细胞。之后撤掉药物，使用完全培基对其进行培养和单克隆筛选。最后，使用WesternBlot对单克隆细胞进行鉴定，从而获得HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。

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（2015-04-13收稿）

Construction of HeLa SND1 knockout gene stable strain by using modified CRISPR/Cas9 gene editing system

LIU Yu-ying1,CUI Xiao-teng1,GAO Xing-jie2,ZHAO Xiu-juan3,FU Xue1,GE Lin1,SU Chao2,YANG Jie1.2
（Tianjin Medical University 1.Department of Biochemistry;2.Research Center of Basic Medical Science;3.Department of Cell Biology, Tianjin 300070,China）

Objective：To apply modified CRISPR/Cas9 gene editing system to knock out the SND1 gene in HeLa cell and construct HeLa SND1 gene knockout stable strain.Methods：A pair of sgRNAs that could specially identify the upstream and downstream of SND1 gene second promoter were designed,then a recombinant eukaryotic expressional plasmid by the carrier of PX462 was constructed.After enzyme digestion and sequencing,a pair of recombinant plasmids into HeLa cell were co-transfected,then puromycin was used to screen positive cell and the monoclonal cell was developed.The knockout effect was measured by western blotting.Results：sgRNA was correctly inserted into the PX462 recombinant plasmid,and SND1 protein was undetected in HeLa cell after transfection and screening of monoclonal cell.Conclusion：HeLa SND1 gene knockout stable strain can be successfully built.

SND1;gene knockout;CRISPR/Cas9;HeLa cells

Q7

A

1006－8147（2015）06-0480-04

刘郁莹（1986-），女，硕士在读，研究方向：肿瘤免疫；通信作者：杨洁，E-mail：yangji@tmu.edu.cn。