利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株
2015-03-01刘郁莹崔晓腾高星杰赵秀娟付雪葛林苏超杨洁
刘郁莹,崔晓腾,高星杰,赵秀娟,付雪,葛林,苏超,杨洁,
(天津医科大学1.生物化学系;2.基础医学研究中心;3.细胞生物学系,天津 300070)
论著
利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株
刘郁莹1,崔晓腾1,高星杰2,赵秀娟3,付雪1,葛林1,苏超2,杨洁1,2
(天津医科大学1.生物化学系;2.基础医学研究中心;3.细胞生物学系,天津 300070)
目的:利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除HeLa细胞中SND1基因,构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。方法:设计一对特异性识别SND1基因第二个启动子的上下游sgRNA,以PX462质粒为载体,构建出一对重组真核表达质粒。酶切和测序鉴定后,将一对重组质粒共同转染进入HeLa细胞中,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,挑取单克隆细胞进行培养。最后用Western Blot鉴定敲除效果。结果:sgRNA正确插入到PX462质粒载体中,转染并筛选单克隆后的细胞中没有SND1蛋白的表达。结论:成功构建出HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。
SND1;基因敲除;CRISPR/Cas9;HeLa细胞
人类SND1(Staphylococcal Nuclease Domain-Containing Protein 1)蛋白是在不同种属间具有高度保守性的蛋白质[1-4],广泛参与细胞多种生物学过程[5-8]。本实验是利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统,即以一对单链向导RNA(single guide-RNA, sgRNA)靶标SND1基因,招募Cas9核酸酶的突变体Cas9n核酸切口酶(Cas9 D10 nickase,Cas9n)对其进行切割,从而敲除SND1基因,构建出HeLa细胞SND1基因敲除稳定株,为更加深入地研究SND1蛋白的功能提供了一个SND1基因敲除的人类细胞模型。
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器 HeLa细胞为本实验室留存;真核表达质粒pSpCas9n(BB)-2A-Puro(PX462)由天津医科大学吴旭东教授惠赠;trans1-T1感受态细胞、Trans2K PlusII DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司;限制性内切酶BbsI、DMEM高糖培养基购自Thermo公司;T4连接酶购自NEB公司;质粒保护的核酸外切酶(plasmid safe exonuclease)购自Epicentre公司;去内毒素质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Biomiga公司;Neofect转染试剂购自零客创智生物科技有限公司;BCA蛋白测定试剂盒购自Pierce公司;鼠源SND1蛋白抗体为本实验室自制[9];β-tubulin蛋白抗体购自Sigma公司;辣根过氧化物酶标记的抗鼠源IgG二抗购自Fermentas公司;LumiGLo化学发光底物购于KPL公司;RIPA裂解液、嘌呤霉素(puromycin)购自北京索莱宝科技有限公司。CO2培养箱购自Thermo公司;Western blot电泳槽、电泳仪购自Bio-Rad公司。sgRNA序列合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成;质粒测序由北京天一辉远生物科技有限公司完成。
1.2 实验方法
1.2.1 针对SND1基因序列的sgRNA设计 (1)采用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站确定人类SND1(NM_014390.2)的基因序列。(2)根据文献提示[10],使用 http://crispr.mit.edu/设计 SND1基因 double nick的上下游sgRNA。sgRNA设计原则:(1)sgRNA的5′端第一个碱基若不是G,则需要在前面加上1个G;(2)以sgRNA序列为模版,设计出其互补链;(3)sgRNA及其互补链分别添加BbsI的酶切位点。
1.2.2 重组真核表达质粒PX462-sgRNA的构建 (1)PX462载体线性化:使用快速限制性内切酶BbsI线性化PX462质粒载体,切胶回收。体系:1 μg PX462载体,1 μL BbsI,1 μL FastAP,2 μL 10×Green FastDigest Buffer,加水稀释至20 μL。程序:37℃,30 min;4℃,stop。(2)sgRNA的合成及形成二聚体:人工合成sgRNA寡核苷酸链A、B及其互补链,使用降落PCR退火形成二聚体。体系:100 nmol sgRNA-A/B,100 nmol sgRNA-A/B的互补链,1 μL 10×T4 Ligation Buffer,0.5 μL T4 PNK,加水至10 μL。程序:37℃,30 min;95℃,5 min;-1℃/min,至25℃;4℃,stop。(3)sgRNA二聚体与PX462线性载体连接:PX462载体和降落PCR产物比例为1∶3,室温(25℃)反应60min。体系:PX462线性载体50ng,降落PCR产物150 ng,1 μL 10×T4 Ligation Buffer,加水稀释至10 μL,1 μL T4 Ligase。程序:25℃,60 min;4℃,stop。(4)重组质粒纯化:使用质粒保护的核酸外切酶去除非特异连接。体系:11μL二聚体与载体连接后的产物,1.5 μL 10×PlasmidSafe Buffer,1.5 μL 10mmolATP,1μLPlasmidSafeexonuclease。程序:37℃,30 min;4℃,stop。(5)转化trans1-T1感受态细胞,挑取单克隆摇菌,使用去内毒素质粒小提试剂盒提取质粒,进行酶切和测序验证。
1.2.3 重组真核表达质粒的酶切鉴定 使用快速限制性内切酶BbsI对PX462质粒载体、PX462-sgRNA-A、PX462-sgRNA-B进行酶切。体系:1 μg质 粒 ,1 μL BbsI,1μL FastAP,2 μL 10×Green FastDigest Buffer,加水稀释至20 μL。程序:37℃,30 min;4℃,stop。酶切后,使用1%的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。
1.2.4 HeLa细胞培养及转染 以去内毒素质粒提取试剂盒提取无内毒素质粒载体PX462和重组真核表达质粒PX462-sgRNA-A、PX462-sgRNA-B。 HeLa细胞接种至6 cm皿中,加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,置于37℃、5%的CO2培养箱中培养,至细胞50%~60%汇合时,根据产品说明书使用Neofect转染试剂瞬时转染质粒载体PX462(HeLa-SND1-WT)或共转重组真核表达质粒PX462-sgRNA-A和 PX462-sgRNA-B(HeLa-SND1-KO)。
1.2.5 HeLa细胞SND1基因敲除稳定株的单克隆筛选 转染后48 h,更换培基为含有2 μg/mL Purom ycin和10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,以未转染的HeLa细胞为阴性对照。加药48 h后,未转染的HeLa细胞全部被杀死。72 h后撤去培基中的Puromycin继续培养。待细胞长满,将细胞用胰酶消化,铺到10 cm皿中,平均每个显微镜低倍镜视野中有3~5个细胞即可。待细胞长成单克隆集落,用枪头分别将单克隆集落轻轻刮取,移至96孔板中培养。待96孔板长满,移至24孔板中继续培养。1.2.6 HeLa细胞SND1基因敲除稳定株Western Blot检测 将筛选后的单克隆稳定株HeLa-SND1-WT和HeLa-SND1-KO分别传至6 cm皿中培养。待细胞长满,使用预冷的PBS缓冲液对细胞洗涤3次,吸净PBS后,加入300μL RIPA裂解液,用干净的细胞刮刮取细胞至1.5 mL离心管中,冰上静置裂解15 min。之后对其进行超声处理,强度60%,时间30 s(1次10 s,间隔5 s,共进行3次)。4℃13 000 r/min超速离心10 min,取上清细胞裂解液。用BCA蛋白测定试剂盒测定裂解液的蛋白浓度后,加入5×上样缓冲液(50%甘油,10%SDS,0.5%溴酚蓝,250 mmol pH6.8 Tris-HCl),99℃对其热变性10 min。进行8% SDS-PAGE电泳后,用湿电转膜仪将PAGE胶上蛋白质转移到0.45 μm PVDF上。使用含有5%脱脂牛奶的TBST溶液封闭2 h后,用自制鼠源SND1抗体4℃孵育过夜。使用TBST溶液洗涤PVDF膜3次,每次10 min。用辣根过氧化物酶标记的抗鼠源IgG二抗室温孵育2 h。之后再用TBST溶液洗涤PVDF膜3次,每次10 min。孵育LumiGLo化学发光底物1 min,进入暗室曝光。
2 结果
2.1 sgRNA靶点的选择及寡核苷酸链的设计 由于SND1基因第1个外显子区(expressed region 1, EXON 1)和基因编码区(Coding Sequence,CDS)的重叠区域过短,因此选取第2个外显子区进行sgRNA设计。CRISPR/Cas9系统工作示意图如图1。设计好的sgRNA及其互补链如表1。
图1 CRISPR/Cas9系统切割SND1基因外显子上下游Fig 1 CRISPR/Cas9 system cut the upstream and downstream of SND1
表1 上下游sgRNA及其互补链寡核苷酸序列Tab 1 The nucleotide sequences of the upstream and downstreamsgRNA
2.2 重组真核表达质粒PX462-sgRNA的酶切和测序结果 利用BbsI限制性内切酶对构建好的PX462-sgRNA-A和PX462-sgRNA-B进行酶切。结果如图2 A,成功构建的质粒不含有BbsI酶切位点,因此不能被切割为线性。测序结果如图2 B,插入序列的位置、方向均正确,质粒构建成功。
图2 重组真核表达质粒的酶切和测序结果Fig 2 The enzyme digestion and sequencing of recombinant eukaryotic expressional plasmid
2.3 Western blot检测HeLa细胞SND1基因敲除稳定株中SND1蛋白的表达 结果如图3,同HeLa-SND1-WT相比,HeLa-SND1-KO中的SND1没有表达,HeLa细胞SND1基因敲除稳定株构建成功。
图3 单克隆稳定株Western blotFig 3 Western blotting of monoclonal stable strain
3 讨论
SND1蛋白序列在不同生物中具有高度的保守性,参与调控细胞多种重要的生理过程。有研究表明,SND1蛋白在肿瘤迁移中也有作用[11]。因此,建立稳定敲除SND1蛋白的细胞株有助于研究其生理病理条件下的功能。
本实验中,我们利用CRISPR/Cas9系统来完成对HeLa细胞中SND1基因的靶向性敲除。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences,CRISPR)序列本是细菌抵御病毒入侵的防御机制,近年来科学家对其进行改造,成为基因编辑的又一有力武器。传统CRISPR/Cas9系统是以sgRNA为向导,靶标目的基因,招募Cas9核酸酶对DNA双链进行切割,从而敲除该基因[12]。对比 ZFN(Zinc-finger nucleases) 技术和 TALEN(transcription activator-like effector nucleases)技术,此方法简便易行,成为靶向基因编辑的重要技术。但是由于sgRNA长度的局限,传统CRISPR/Cas9系统容易产生脱靶效应,即sgRNA识别到其他基因处,导致其他基因敲除。麻省理工学院的Zhang等[13]对其进行改良,将Cas9核酸酶的RuvC结构域中的天冬氨酸突变成丙氨酸(D10A),导致RuvC结构域失去活性,突变后的Cas9酶变成Cas9n核酸切口酶,只能切割单链。如果DNA只被一个Cas9n切割,产生单链缺口,细胞很快利用碱基切除修复途径进行DNA修复。因此使用一对sgRNA对目的基因上下游进行靶标并招募Cas9n进行切割,导致细胞利用非同源性末端接合(non-homologous end joining,NHEJ)机制进行DNA修复。此修复机制并不精确,易产生框移突变,从而达到敲除目的基因的作用。
实验中,我们选择PX462质粒作为载体,该质粒可以同时表达Cas9n和插入的sgRNA,简化了表达Cas9n质粒和sgRNA质粒共转染的步骤。转染后,使用2 μg/mL Puromycin进行阳性细胞筛选。同时使用未转染的HeLa细胞作为对照,也加入2 μg/mL Puromycin,待该细胞全部杀死时,即认为转染组存活下来的细胞为带有Puromycin抗性的阳性细胞。之后撤掉药物,使用完全培基对其进行培养和单克隆筛选。最后,使用WesternBlot对单克隆细胞进行鉴定,从而获得HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。
[1] Saarikettu J,Ovod V,Vuoksio M,et al.Monoclonal antibodies against human Tudor-SN[J].Hybridoma(Larchmt),2010,29(3):231
[2] Rodríguez L,Ochoa B,Martínez M J.NF-Y and Sp1 are involved in transcriptional regulation of rat SND p102 gene[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,356(1):226
[3]Broadhurst M K,Lee R S,Hawkins S,et al.The p100 EBNA-2 coactivator:a highly conserved protein found in a range of exocrine and endocrine cells and tissues in cattle[J].Biochim Biophys Acta, 2005,1681(2/3):126
[4] Zhao C T,Shi K H,Su Y,et al.Two variants of zebrafish p100 are expressed during embryogenesis and regulated by Nodal signaling [J].FEBS Lett,2003,543(1/3):190
[5] Liu X,Dong L,Zhang X,et al.Identification of p100 target promoters by chromatin immunoprecipitation-guided ligation and selection(ChIP-GLAS)[J].Cell Mol Immunol,2011,8(1):88
[6] Gao X,Zhao X,Zhu Y,et al.Tudor staphylococcal nuclease(Tudor-SN)participates in small ribonucleoprotein (snRNP)assembly via interacting with symmetrically dimethylated Sm proteins[J].J Biol Chem,2012,287(22):18130
[7] Su C,Zhang C,Tecle A,et al.Tudor staphylococcal nuclease (Tudor-SN),a novel regulator facilitating G1/S phase transition, acting as a co-activator of E2F-1 in cell cycle regulation[J].J Biol Chem,2015,290(11):7208
[8] Gao X,Fu X,Song J,et al.Poly(a)(+)mRNA-binding protein Tudor-SN regulates stress granules aggregation dynamics[J].FEBS J,2015,282(5):874
[9] Saarikettu J,Ovod V,Vuoksio M,et al.Monoclonal antibodies against human Tudor-SN[J].Hybridoma(Larchmt),2010,29(3):231
[10]Ran F A,Hsu P D,Wright J,et al.Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system[J].Nat Protoc,2013,8(11):2281
[11]Yu L,Liu X,Cui K,et al.SND1 Acts downstream of TGFβ1 and upstream of smurf1 to promote breast Cancer metastasis[J].Cancer Res,2015,75(7):1275
[12]Gilbert L A,Larson M H,Morsut L,et al.CRISPR-Mediated modular RNA-Guided regulation of transcription in eukaryotes[J]. Cell,2013,154(2):442
[13]Ran F A,Hsu P D,Lin C Y,et al.Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity[J].Cell,2013, 154(6):1380
(2015-04-13收稿)
Construction of HeLa SND1 knockout gene stable strain by using modified CRISPR/Cas9 gene editing system
LIU Yu-ying1,CUI Xiao-teng1,GAO Xing-jie2,ZHAO Xiu-juan3,FU Xue1,GE Lin1,SU Chao2,YANG Jie1.2
(Tianjin Medical University 1.Department of Biochemistry;2.Research Center of Basic Medical Science;3.Department of Cell Biology, Tianjin 300070,China)
Objective:To apply modified CRISPR/Cas9 gene editing system to knock out the SND1 gene in HeLa cell and construct HeLa SND1 gene knockout stable strain.Methods:A pair of sgRNAs that could specially identify the upstream and downstream of SND1 gene second promoter were designed,then a recombinant eukaryotic expressional plasmid by the carrier of PX462 was constructed.After enzyme digestion and sequencing,a pair of recombinant plasmids into HeLa cell were co-transfected,then puromycin was used to screen positive cell and the monoclonal cell was developed.The knockout effect was measured by western blotting.Results:sgRNA was correctly inserted into the PX462 recombinant plasmid,and SND1 protein was undetected in HeLa cell after transfection and screening of monoclonal cell.Conclusion:HeLa SND1 gene knockout stable strain can be successfully built.
SND1;gene knockout;CRISPR/Cas9;HeLa cells
Q7
A
1006-8147(2015)06-0480-04
刘郁莹(1986-),女,硕士在读,研究方向:肿瘤免疫;通信作者:杨洁,E-mail:yangji@tmu.edu.cn。