5-杂氮-2′-脱氧胞苷上调CK13表达并抑制人肺鳞癌YTMLC-9细胞增殖

姚 芳，张 鹏，王元国

（天津医科大学总医院心胸外科，天津300052）

论著

5-杂氮-2′-脱氧胞苷上调CK13表达并抑制人肺鳞癌YTMLC-9细胞增殖

姚 芳，张 鹏，王元国

（天津医科大学总医院心胸外科，天津300052）

目的：探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine）对人肺鳞癌YTMLC-9细胞株增殖的影响及对细胞角蛋白13（CK13）表达和CK13基因甲基化的影响。方法：采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测不同浓度（1、2、5、10，20、40 μmol/L）5-aza-2′-deoxycytidine处理1～4 d后的5-aza-2′-deoxycytidine对人肺鳞癌YTMLC-9细胞株生长的影响；采用半定量PCR及Western blot检测5 μmol/L的5-aza-2′-deoxycytidine作用YTMLC-9 1～4 d CK13的表达；采用甲基化PCR检测不同浓度（1、2、5、10 μmol/L）5-aza-2′-deoxycytidine处理48 h后CK13甲基化和非甲基化的变化。结果：5-aza-2′-deoxycytidine对人肺鳞癌YTMLC-9细胞株的生长具有明显地抑制作用，当用药浓度高于20 μmol/L后产生明显的细胞毒性；5-aza-2′-deoxycytidine能够上调CK13基因表达，呈时间依赖性。结论：5-aza-2′-deoxycytidine抑制人肺鳞癌YTMLC-9细胞的生长，抑制作用呈浓度、时间依赖性。5-aza-2′-deoxycytidine可以使CK13重新表达。其生物学效应可能与CK13启动子甲基化状态改变有关。

5-aza-2′-deoxycytidine；YTMLC-9；细胞增殖；DNA甲基化；CK13

肺癌是最为常见的恶性肿瘤，近50年来世界上很多国家的肺癌发病率和死亡率一直呈上升趋势。据我国居民死因调查，肺癌死亡率20年间增加近1.5倍，在恶性肿瘤中增长最快。肺癌发生涉及遗传学及表观遗传学，近年来表观遗传学改变在肿瘤中的作用受到广泛重视，表观遗传学的研究对象是基因表达在时间和空间上的调控问题，其中最主要的两个研究内容是甲基化和组蛋白修饰，抑癌基因启动子甲基化参与的基因转录调控，己成为目前分子生物学领域研究基因表达调控的热点。DNA甲基化可以影响抑癌基因表达，但并不改变DNA本身的序列和基因产物，因此这种改变可逆。运用DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）抑制剂5-杂氮2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine）通过DNA去甲基化作用可使多种CpG岛过甲基化的抑癌基因重新表达，从而恢复抑癌功能[1-2]。CK13基因是黏膜非角化复层鳞状上皮终末分化的标志，可作为细胞恶性程度的标志。近年来，对CK13基因在鳞状细胞癌中的研究日益趋多，现有资料证明CK13基因与多种疾病的发生发展密切相关[3-6]，CK13表达减低与其基因转录起始点上游CpG岛过甲基化有关[7]。本研究用甲基转移酶抑制剂5-杂氮2′-脱氧胞苷处理人肺鳞癌细胞系YTMLC-9，观察其对肺癌细胞生长增殖的影响及对CK13基因表达的影响，探讨其影响肿瘤细胞生物活性的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺鳞癌YTMLC-9细胞株由本实验室保存，RPMI 1640培养基和胎牛血清购自美国Gibico公司，5-aza-2′-deoxycytidine购自美国Sigma公司，噻唑蓝（MTT）购自美国Sigma公司，二甲基亚砜（DMSO）购自美国Amresco公司，无菌6孔板、96孔培养板购自丹麦Corning公司；提取RNA的Trizol、La Taq酶、2×GC Buffer、dNTP mixture、6× Loading Buffer等购自大连宝生物工程有限公司（Takara），DNA Marker DL2000、DNA提取试剂盒购自北京Tiangen生物技术有限公司，引物（北京奥科生物技术有限公司），CK13基因鼠抗人IgG单克隆抗体（美国Abcam公司），β-actin基因鼠抗人IgG抗体（北京博奥森公司），辣根酶标记山羊抗鼠IgG（北京中杉金桥公司），DNA重亚硫酸盐修饰试剂盒购自美国Epigentek生物公司。

1.2 设备 医用洁净工作台（美国Baker公司），水套式二氧化碳培养箱（美国Thermo Forma公司），空气摇床（美国Thermo Forma公司）；多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司），PCR扩增仪(杭州晶格科学仪器公司；光学显微镜购自德国莱卡公司。

1.3 细胞培养及药物处理

1.3.1 细胞培养 人肺鳞癌细胞株YTMLC-9常规培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液（pH 7.4）中，在37℃、5%CO2、充分湿度条件下的培养箱中培养，细胞呈贴壁生长，每2～3 d传代1次。传代时用含EDTA的胰酶37℃消化3～5 min，选用对数生长期细胞用于实验。

1.3.2 试剂配置 5-aza-2′-deoxycytidine用DMSO溶解配成浓度为2.0×105μmol/L的储存液，-20℃保存，使用时用PRMI 1640培养液稀释为工作液。MTT溶于PBS中，过滤除菌，浓度为5 mg/mL，避光冷藏。

1.4 MTT法检测细胞生长情况 采用5-aza-2′-deoxycytidine对人肺鳞癌细胞株YTMLC-9的生长抑制率进行测定。将对数生长期细胞以1×104个/孔的密度接种于无菌96孔培养板，每孔体积为180 μL。过夜贴壁后，每孔各自加入 5-aza-2′-deoxycytidine使终浓度为1、2、5、10、20、40 μmol/L，以不加药物为阴性对照组，终体积200 μL。共6组，每种浓度设3个复孔，于37℃、5%CO2条件下培养处理24、48、72、96 h后每孔加入5 g/L的MTT，继续培养4 h后，吸去培养基，每孔加入DMSO 80 μL，震荡10 min，使紫蓝色结晶完全溶解，用酶标仪以570 nm为波长测吸光度值。细胞生长抑制率＝（对照组吸光值-实验组吸光值）/对照组吸光值×100%，以上实验重复3次。以细胞生长抑制率（%）为纵坐标，作用时间为横坐标，绘制生长曲线。

1.5 半定量RT-PCR检测CK13表达 将对数生长期细胞以2×105个/孔的密度接种于无菌6孔培养板。过夜贴壁后，每孔各自加入5-aza-2′-deoxycytidine使终浓度为5 μmol/L，以不加药物为阴性对照组，每天换药，分别培养24、48、72、96 h后提取RNA，检测RNA质量及浓度后，逆转录成cDNA，按照说明书进行。以cDNA为模板，分别以如下引物进行PCR扩增。CK13的引物序列（扩增产物为124 bp）：上游5′-GTGACTGGCACCTGAAG CA-3′，下游5′-AGGATGACCCGGTTGTTTT-3′；内参GAPDH的引物序列（扩增产物为152 bp）：上游：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游：5′-GGGTGGAATCATATTGGAAC-3′。PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5 μL；dNTP（2.5 μmol/L）2 μL；上游引物（10 μmol/L）1 μL；下游引物（10 μmol/L）1 μL；cDNA 1 μL；Easy Taq 0.125 μL；加ddH2O至25 μL。于PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应条件：预变性94℃3 min，变性94℃30 s，退火56℃30 s，延伸72℃30 s，35个循环；终止72℃10 min。取5 μL的PCR扩增产物与1 μL 6×Loading Buffer混合均匀后在含溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶200 V电压电泳10 min分离，紫外凝胶成像系统观察分析结果。

1.6 Western blot检测CK13蛋白表达 将对数生长期细胞以2×105个/孔的密度接种于无菌6孔培养板。过夜贴壁后，每孔各自加入5-aza-2′-deoxycytidine使终浓度为5 μmol/L，以不加药物为阴性对照组，每天换药，分别培养24、48、72、96 h后收集细胞，提取蛋白，BCA法测蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳分离细胞总蛋白，将蛋白通过电转移印迹到NC膜上，5%脱脂奶粉/TBST液封闭；蛋白上样量分别为30 g，CK13工作浓度为1∶1 000，β-actin工作液浓度为1∶1 000，二抗工作浓度为1∶10 000，ECL试剂发光，X线胶片曝光、显影、定影，将条带扫描后灰度分析。

1.7 MSP检测CK13甲基化

1.7.1 细胞培养、药物作用及基因组DNA的提取与检测 将对数生长期细胞以2×105个/孔的密度接种于无菌6孔培养板。过夜贴壁后，每孔各自加入 5-aza-2′-deoxycytidine使终浓度为1、2、5、10 μmol/L，以不加药物为阴性对照组，每天换药，培养72 h后进行提取基因组DNA（gDNA），按照说明书进行，同时提取健康志愿者外周血淋巴细胞DNA作为阳性对照，用紫外分光光度计测定gDNA的浓度和纯度，凝胶电泳质检，检测gDNA完整性。外周血淋巴细胞DNA首先经甲基化酶处理：模板DNA 5 μg，10×buffer 4 μL，50×SAM 2 μL，SssI甲基化酶4 μL，去离子水补至40 μL，37℃水浴6 h。经SssI甲基转移酶处理的DNA作为甲基化阳性对照，未经该酶处理的DNA作为阴性对照，之后进行重亚硫酸盐修饰，用于MSP检测。

1.7.2 gDNA重亚硫酸盐修饰 操作步骤严格按照美国Epigentek生物公司的gDNA重亚硫酸盐修饰试剂盒推荐方案进行，将得到的gDNA用于下一步实验或分装冻存于-20℃备用。

1.7.3 甲基化特异性PCR（MSP）检测CK13基因启动子区甲基化状态 引物设计：本研究甲基化和非甲基化两对引物设计序列见表1。

表1 CK13引物序列及产物长度Tab 1 The PCR primers and products lengths

以重亚硫酸氢盐修饰的DNA为模板，分别以甲基化和非甲基化引物进行PCR扩增。PCR反应体系：2×GC buffer 12.5 μL；dNTP（2.5 μmol/L）2 μL；上游引物（10 μmol/L）1 μL；下游引物（10 μmol/L）1 μL；Template（修饰后gDNA）2 μL；LA Taq 0.3 μL；加ddH2O至25 μL。于PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应条件：预变性95℃10 min，变性94℃30 s，退火68℃（非甲基化60℃）45 s，延伸72℃60 s，40个循环；终止72℃6 min。

1.7.4 PCR结果的判读 取5 μL的PCR扩增产物与1 μL 6×Loading Buffer混合均匀后在含溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶200 V电压电泳10 min分离，紫外凝胶成像系统观察分析结果。用甲基化特异性引物扩增出特异性产物表明存在DNA甲基化，仅非甲基化特异性引物扩增出特异性产物者表明不存在DNA甲基化，若同时出现扩增产物则考虑DNA部分甲基化，凝胶成像系统成像。

2 结果

2.1 5-aza-2′-deoxycytidine对YTMLC-9细胞增殖的影响 MTT检测发现5-aza-2′-deoxycytidine对人肺鳞癌细胞株YTMLC-9细胞增殖的抑制作用呈浓度（1～10 μmol/L）依赖性（P<0.05）；呈时间依赖性（24～96 h）（P<0.05），见图1。但20 μmol/L 5-aza-2′-deoxycytidine作用的细胞产生细胞毒性，40 μmol/L浓度组细胞毒性明显增强。

图1 MTT法测定YTMLC-9在不同5-aza-2′-deoxycytidine浓度下的96 h细胞生长抑制率Fig 1 MTT cell proliferation assay in YTMLC-9 cell line

2.2 5-aza-2′-deoxycytidine对 YTMLC-9细胞CK13的mRNA表达的影响 细胞PCR电泳结果用 5 μmol/L的 5-aza-2′-deoxycytidine处理YTMLC-9细胞，经图像处理分析统计，GAPDH灰度值为参照，所有药物组与对照组比较CK13 mRNA表达均增高，且随着作用时间增加，CK13 mRNA表达水平上升，用药24、48、72、96 h组较对照组上升百分比分别为 26.5%、68.7%、86.7%、209.6%（P<0.05）[上升百分比=（实验组值－对照组值）/对照组值）×100%]，见图2、3。

图2 5-aza-2′-deoxycytidine不同时间YTMLC-9细胞CK13的mRNA表达水平Fig 2 Changes of CK13 mRNA levels in YTMLC-9 cell line

图3 5-aza-2′-deoxycytidine不同时间YTMLC-9细胞CK13的mRNA表达水平Fig 3 Changes of CK13 mRNA levels in YTMLC-9 cell line

2.3 5-aza-2′-deoxycytidine对 YTMLC-9细胞CK13蛋白表达的影响 用5 μmol/L的5-aza-2′-deoxycytidine处理YTMLC-9细胞，经图像处理分析统计，β-actin灰度值为参照，所有药物组与对照组比较CK13蛋白表达均增高，且随着用药时间增加，CK13蛋白表达水平上升，用药24、48、72、96 h组较对照组上升百分比分别为 109.3%、301.3%、397.3%、478.7%（P<0.05）[上升百分比=（实验组值－对照组值）/对照组值）×100%]，见图4、5。

图4 5-aza-2′-deoxycytidine不同时间YTMLC-9细胞CK13的蛋白表达水平Fig 4 Changes of CK13 protein levels in YTMLC-9 cell line

2.4 5-aza-2′-deoxycytidine对 YTMLC-9细胞CK13基因甲基化的影响 用1～10 μmol/L的5-aza-2′-deoxycytidine处理YTMLC-9细胞，随着用药浓度的增加，CK13发生去甲基化，甲基化逐渐减少，非甲基化逐渐增多，与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05），但10 μmol/L的5-aza-2′-deoxycytidine仍不能使CK13完全去甲基化，见图6。

图5 5-aza-2′-deoxycytidine不同时间YTMLC-9细胞CK13的蛋白表达水平Fig 5 Changes of CK13 protein levels in YTMLC-9 cell line

图6 5-aza-2′-deoxycytidine对YTMLC-9细胞CK13基因甲基化的影响Fig 6 Changes of the methylation level of CK13 in YTMLC-9 cell line

3 讨论

基因组的不稳定通常会引起遗传物质改变，引发多种疾病，尤其是肿瘤和癌症。细胞采用多种机制来保证DNA复制的真实性。DNA甲基化在DNA复制起始、错配修复以及转座子的失活等过程中对维持遗传信息的稳定性发挥着重要作用[8-9]。DNA甲基化对基因的抑制活性是多方面导致的，DNA甲基化可能直接影响一些转录因子的结合活性或DNA甲基化结合蛋白抑制了转录因子的结合。在细胞中有些转录因子的特异结合位点中有CpG位点，这些位点发生甲基化的时候，就降低了转录因子与启动子的结合效率，从而减低基因的转录率。在多种癌细胞中有抑癌基因的过度甲基化，而这种过度甲基化与细胞内高水平的DNMT是一致的。DNMT抑制剂能使因CpG岛过甲基化而失活的抑癌基因重新表达，进而抑制肿瘤细胞生长增殖。

DNA去甲基化治疗已被证实在骨髓增生异常综合征（MDS）、白血病AML、CML的治疗中取得较好疗效。Liu等[2]发现5-aza-2′-deoxycytidine能呈时间和剂量依赖性抑制T淋巴细胞白血病细胞系Molt4细胞的增殖，并能诱导细胞凋亡，使细胞阻滞于G0/G1期。0.50 μmol/L地西他滨处理72 h后，Molt4细胞LTF基因启动子甲基化率较低，mRNA和蛋白表达增加，caspase 3、caspase 9凋亡蛋白表达增加[10]。Zhang[11]报道了1例难治性AML（58%原始细胞）患者用5-aza-2′-deoxycytidine预处理后成功进行造血干细胞移植。Kadia等[12]研究发现5-aza-2′-deoxycytidine能够改善AML患者的预后。Hwang等[13]发现SPINT2具有肿瘤抑制活性，其功能可能与抑制细胞外调节信号HGF有关。在黑色素瘤中SPINT2沉默，而5-aza-2′-deoxycytidine处理后可以使SPINT2恢复转录活性。Zych等[1]研究发现5-aza-2′-deoxycytidine可以减少脂肪细胞增殖及分化，导致PPARG、FABP4下调，GATA2上调。但在不同组织中5-aza-2′-deoxycytidine作用不同。Pandey等[14-15]研究发现，在光动力疗法（PDT）治疗环境下，多种肿瘤模型中应用5-aza-2′-deoxycytidine可以释放多种肿瘤相关抗原（TAA）。免疫系统可以识别由肿瘤表面MHC I类分子呈递的TAA，然后CTLs通过穿孔素和颗粒酶破坏肿瘤细胞。因此5-aza-2′-deoxycytidine潜在地增强免疫系统而抗肿瘤从而延长生存期。虽然5-aza-2′-deoxycytidine可作用于血液系统肿瘤，但由于5-aza-2′-deoxycytidine的细胞毒性及复甲基化，在实体肿瘤中的作用却令人失望[16]。

研究显示CK13基因与多种鳞癌的发生发展密切相关，在口腔癌、鼻咽癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、皮肤癌等失表达，肿瘤抑制活性降低。CK13基因阳性表达率与鳞癌的组织分化程度相关，其表达随肿瘤分化程度下降而下降，并且随原发肿瘤的增大及向周围的侵袭而表达逐步减少，证明该基因可能参与了肿瘤组织由高到低分化的演进过程[17-23]。研究显示，在癌细胞中，CK13的失活可能是通过CpG启动子的过度甲基化来实现的。Winter等[7]发现CK13的组织特异性表达及在上皮性肿瘤中的异常表达与CK13基因转录起始点上游的CpG甲基化密切相关，CpG低甲基化导致CK13基因表达，CpG岛高甲基化导致CK13基因失活。因此5-aza-2′-deoxycytidine的生物学活性可能与CK13存在密切关系。

本研究中，笔者探讨了5-aza-2′-deoxycytidine对肺癌细胞增殖的影响。数据显示，5-aza-2′-deoxycytidine在较低浓度1 μmol/L时就抑制细胞生长，在10 μmol/L作用时，细胞就不再生长并凋亡，但是更高浓度的药物就会产生细胞毒性。以往研究显示0.1 μmol/L或0.5 μmol/L 5-aza-2′-deoxycytidine可以使宫颈癌细胞T24去甲基化并且有很低的毒性，提高浓度后药物会集合到复制的DNA中产生细胞毒性但是不抑制DNA甲基化。Liu等[2]研究发现5-aza-2′-deoxycytidine促进HXO-RB44细胞凋亡，并使细胞周期停滞在G0/G1期，MSP检测显示5-aza-2′-deoxycytidine作用浓度在0.5～5 μmol/L时，RASSF1A DNA非甲基化增加，甲基化减少，并呈剂量依赖性。在5 μmol/L药物浓度作用HXORB44第4天，RASSF1A完全去甲基化，并且在第4天至第7天，RASSF1A表达明显增加。Kantarjian等[24]认为低剂量的5-aza-2′-deoxycytidine可以去甲基化，使基因重新表达，而不是最大耐受剂量。但研究者相信5-aza-2′-deoxycytidine通过使凋亡诱导基因的去甲基化重新恢复活性而产生抑癌作用，目标主要在于复表达的基因或信号通路[25]。笔者研究也显示5-aza-2′-deoxycytidine具有去甲基化作用，使抑癌基因CK13重新表达，并且呈时间依赖性。5 μmol/L的5-aza-2′-deoxycytidine可以有效抑制CK13基因启动子甲基化。随着浓度的提高，CK13基因启动子去甲基化明显增加，但不能完全去甲基化。考虑药物作用时间也是基因启动子去甲基化的一个影响因素或者存在复甲基化。当药物浓度增高至产生细胞毒性时CK13并未完全去甲基化，此时药物不再对CK13的去甲基化有明显作用。数据表明由5-aza-2′-deoxycytidine诱导的CK13基因启动子的去甲基化及重新表达对于细胞生长抑制、凋亡具有重要作用。

该研究显示5-aza-2′-deoxycytidine可以抑制肺癌细胞生长，促进细胞凋亡，其作用可能与其使CK13去甲基化，重新表达有关。临床上，只有产生细胞毒剂量或最大耐受剂量的 5-aza-2′-deoxycytidine才能抗白血病、骨髓多发性硬化症，并且在治疗Ⅰ、Ⅱ期的实性肿瘤过程中就产生大量的副作用[26]。5-aza-2′-deoxycytidine等更多的去甲基化药物对于治疗肺癌等肿瘤的生物活性机制及可行性需要更多探索。

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（2015-04-13收稿）

5-Aza-2′-deoxycytidine inhibits human lung squamous carcinoma YTMLC-9 cell by epigenetically silenced CK13 gene in vitro

YAO Fang,ZHANG Peng,WANG Yuan-guo
（Department of Cardiothoracic Surgery，General Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China）

Objective：To explore the effect of the DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidine on human lung squamouscarcinoma YTMLC-9 cell lines and the methylation of CK13.Methods：Human lung squamous-carcinoma YTMLC-9 cell lines were treated for 1 to 4 days by 5-aza-2′-deoxycytidine with 1,2,5,10,20,40 μmol/L,respectively.Consequently,the inhibition rate of the cells were detected by MTT assay,and morphological pattern were observed.CK13 mRNA and protein levels were measured by semiquantitative RT-PCR and Western blot,respectively,after cells were treated with 5 μmol/L 5-aza-2′-deoxycytidine for one to four days. The methylation level of CK13 were detected by methylation-specific polymerase chain reaction(MSP).Results：MTT results showed that the proliferation ability of YTMLC-9 cells was inhibited by 5-aza-2′-deoxycytidine from 1 μmol/L to 10 μmol/L.Furthermore, concentration-dependent and time-dependent manner were shown by(P<0.05).But higher concentration drug derived cells especially under 40 μmol/L,were with higher cytoxicity;CK13 expression was reactivated at mRNA and protein level.Incubation time and dose of 5-aza-2′-deoxycytidine also functioned were discovered as factors for the demethylation status of CK13 promoter DNA and CK13 expression.The methylation of CK13 gene promoter was down-regulated by 5-aza-2′-deoxycytidine in a concentration-dependent manner.Conclusion：The proliferation ability of YTMLC-9 cells can be inhibited by 5-aza-2′-deoxycytidine in a concentration-dependent and time-dependent manner.CK13 expression can be reactivated in cells incubated with 5-aza-2′-deoxycytidine.These may associate with the downregulation of CK13 gene promoter methylation.

5-aza-2′-deoxycytidine;human lung squamous-carcinoma YTMLC-9;cell proliferation;DNA methylation;CK13

R734.2

A

1006－8147（2015）06-0474-06

姚芳（1989-），女，硕士在读，研究方向：胸心外科；E-mail: yaofang198902@163.com。