RP-HPLC测定不同产地白蔹药材中没食子酸的含量

乐佳美，熊筱娟，毕宝宝，陆文铨

(1.第二军医大学长征医院，上海 200003；2.宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春 336000；3.河南大学化学化工学院，河南开封 475000)



RP-HPLC测定不同产地白蔹药材中没食子酸的含量

乐佳美1，2，熊筱娟2，毕宝宝3，陆文铨1*

(1.第二军医大学长征医院，上海 200003；2.宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春 336000；3.河南大学化学化工学院，河南开封 475000)

[目的]建立白蔹药材中没食子酸的RP-HPLC含量测定方法，为白蔹药材的质量标准研究提供依据。[方法]采用Dikma Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈- 0.2%磷酸(3∶97)为流动相进行等度洗脱。流速为1.0 ml/min，柱温为30 ℃，检测波长为270 nm。[结果]没食子酸检测浓度在3.15～202 μg/ml的范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系(R2=0.999 9)；平均回收率为102.8%，RSD为1.15%。[结论]该方法快速，重现性好，准确度高，操作简便，可用于白蔹药材的质量控制。

白蔹；没食子酸；反相高效液相色谱法；质量控制

白蔹(Ampelopsisjaponica( Thunb·)Makino)，葡萄科植物，又名野葡萄秧、鹅抱蛋、白草等。据《中药大辞典》记载，白蔹以块根入药，具有清热解毒、生肌止疼、消肿的功效，既可内服，又可外敷，主要用于医治痈肿疮疡、烫伤、扭挫伤等[1-2]。临床广泛应用于治疗化脓性皮肤感染、细菌性痢疾等疾病，疗效显著[3-4]。现代研究表明白蔹中主要含有没食子酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、芦荟大黄素、羽扇豆醇等化合物，没食子酸为白蔹中抗菌、抗病毒的主要药效成分，且其含量较高[5-6]。目前在药典中，白蔹药材的质量标准只有定性分析而无定量分析。为更好地控制白蔹生药材质量，更好地利用白蔹生药资源和适应中药现代化的发展要求，该研究基于2015年版《中国药典》科研课题，采用定量研究白蔹中没食子酸含量的高低来评价白敛生药材质量，以期为制定白蔹药材的质量标准研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1研究对象。白蔹干燥药材由第二军医大学附属长征医院药材科提供，经第二军医大学长征医院陈万生教授鉴定为白蔹A.japonica。

1.1.2主要仪器。Agilent 1260 HPLC系统(Agilent Technologies，美国)，包括G1311A四元泵、G1322A真空脱气机、G1329A自动进样器、G1316A柱温箱和G4212B DAD检测器，使用Chem Station软件数据处理系统；BAS124S-CW万分之一电子分析天平(Sartorius，德国)；BP110S十万分之一电子分析天平(Sartorius，德国)；XW-01定时可调速漩涡混合器(上海医科大学仪器厂)；KUDOS SK7200H 超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；TDL-4A 低速离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)；AG 22331 Humberg超高速离心机(Eppendorf，德国)；Eppendorf Research plus 可调量程移液器(Eppendorf，德国)。

1.1.3主要试剂。没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号110831-201204)；甲醇和乙腈均为色谱纯试剂(Fisher Scientific，美国)；甲酸和磷酸均为色谱级试剂；水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1对照品溶液的制备。精密称取没食子酸对照品适量，加50%甲醇溶液制成每1 ml含202 μg的溶液，即得。

1.2.2供试品溶液的制备。取本品粉末(过四号筛)5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理60 min后，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.3色谱分析条件。色谱柱Dikma Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)，柱号99903；乙腈-0.2%磷酸(3∶97)为流动相；流速1.0 ml/min，柱温30 ℃，检测器为DAD，波长为270 nm。

1.2.4方法学考察。

1.2.4.1系统适应性试验。分别吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μl，在“1.2.3”色谱条件下，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图，考察系统适应性。

1.2.4.2线性关系的考察。将没食子酸对照品贮备液用50%甲醇稀释制成每1 ml含202、 101、50.5、25.25、12.625、6.312 5、3.156 25 μg的系列溶液，分别吸取10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以进样浓度X(μg/ml)为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。

1.2.4.3检测限和定量限的考察。将没食子酸对照品逐步稀释后进样测定，以色谱图中信噪比(S/N)为3时的进样量为最低检测限(LOD)，信噪比(S/N)为10时的进样量为最低定量限(LOQ)。

1.2.4.4稳定性试验。取同一供试样品溶液，按“1.2.3”项色谱分析条件分别于0、4、8、12、24 h进样，进样量10 μl，测定峰面积积分值，计算RSD。

1.2.4.5精密度试验。取按“1.2.1”方法制备的对照品溶液重复进样6次，计算峰面积的RSD值。

1.2.4.6重复性试验。取同一批号的样品按“1.2.2”方法制备供试品溶液6份(样品批号为白蔹02)，按“1.2.3”项下色谱分析条件，进样量为10 μl，测定峰面积，计算平均含量和RSD。

1.2.4.7加样回收试验。取同一批号已知含量的样品6份(样品批号为白蔹02)，精密加入分别与样品中没食子酸含量相等的对照品，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，再按“1.2.3”项下色谱条件测定，进样量为10 μl，测定峰面积，计算平均回收率和RSD。

1.2.5样品的含量测定。按“1.2.2”方法分别精密称取10批不同产地的药材粉末配制成供试品溶液各2份，按“1.2.4.2”方法对样品进行含量测定，通过标准曲线计算不同产地白蔹药材中没食子酸的含量。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1系统适应性试验。图1表明，在“1.2.4.1”条件下，样品谱图中没食子酸的保留时间为14 min左右，与其他化学成分能达到基线分离，其色谱峰与相邻色谱峰分离度良好(与相邻峰的分离度均大于1.5)，符合高效液相色谱定量分析的要求。理论塔板数以没食子酸计为10 000以上。

2.1.2线性关系的考察。按“1.2.4.2”方法操作，峰面积分别为5 674.47、2 785.17、1 372.87、695.40、342.73、163.00、77.10，以进样浓度X(μg/ml)为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线如图2所示，计算得线性回归方程为Y=28.103X-22.027(R2=0.999 9)，表明没食子酸在3.15～202 μg/ml的范围内呈良好的线性关系。

2.1.3检测限和定量限的考察。按“1.2.4.3”方法操作，结果表明，没食子酸的检测限和定量限分别为0.002 2和0.006 3 μg。

2.1.4稳定性试验。按“1.2.4.4”方法操作，计算得出峰面积积分值的RSD为0.80%，表明没食子酸在24 h内比较稳定。

2.1.5精密度试验。按“1.2.4.5”方法操作，计算得峰面积的RSD为0.20%，表明在此试验条件下精密度良好。

2.1.6重复性试验。按“1.2.4.6”方法操作，计算得平均含量为0.027%，RSD为2.30%。表明该方法重复性良好。

2.1.7加样回收试验。由表1可见，平均回收率为102.8%，RSD为1.15%，表明该方法准确、可靠，可用于白蔹药材中没食子酸的含量测定。

2.2 含量测定由表2可知，大部分产地的白蔹药材中没食子酸含量为0.02%～0.03%，而产自湖北的白蔹药材(编号01)中的没食子酸含量明显比其他产地的高，为0.052 25%。

3 结论与讨论

3.1 对照品纯度检查方法采用HPLC等度洗脱，采用DAD检测器检测，样品在190～400 nm范围内，除样品峰外均没有检测到其他峰，样品峰峰面积百分比达100%；增加进样量达到样品出现平头峰时，仍然未检测出其他色谱峰。样品峰的峰纯度分析报告显示，峰纯度达98%。对照品核磁共振图谱显示没有其他杂质信号。

3.2 色谱条件的选择

3.2.1色 谱 柱 的 选 择。该试验对以下3种型号的C18柱进

表1 回收率试验结果(n=6)

表2 样品含量测定结果(n=2)

行考察：Grace Smart RP18(250×4.6 mm，5 μm)，柱号0170301737；Agilent C18(250×4.6 mm，5 μm)，柱号880975-902；Dikma Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)，柱号99903。结果表明三者均能较好地分离没食子酸且峰形较好，出于成本考虑，选用Dikma Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)。

3.2.2柱温的选择。考察了不同柱温(25、30、35 ℃)对分离效果的影响，结果表明柱温对分离效果的影响不大，在合适的流动相条件下，没食子酸峰均能与其他峰达到基线分离，但考虑到其可操作性，在此选用30 ℃。

3.2.3流动相的选择。选择了乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.2%磷酸2种流动相系统进行测定试验，结果表明，在2种流动相系统条件下没食子酸的分离效果差异不大，但乙腈-0.2%磷酸条件下峰形更好，因此最后选择了乙腈- 0.2%磷酸(3∶97)作为流动相，且每次分析结束时加强对色谱柱和液相系统的冲洗和维护。

3.2.4检测波长的选择。取没食子酸对照品的甲醇溶液，用DAD全波长扫描，在220、273 nm波长处有最大吸收。该试验按照《中国药典》2010年版一部附录ⅤA[7]的有关规定，先检查了所使用的乙腈溶剂在供试品测定所用波长附近是符合要求的，结合其他相关文献[8-9]，选择270 nm为测定波长。

因此该试验采用了“1.2.3”项下色谱条件。

3.3 供试品溶液制备方法的选择

3.3.1提取方法的选择。采用2种不同的提取方法(超声、加热回流)提取白蔹中的没食子酸，结果发现，2种方法提取的没食子酸含量分别为0.173 4、0.169 1 mg/g，表明超声法提取效果略优于加热回流提取法，操作简单，故选用超声法。

3.3.2提取溶剂的选择。选用了不同溶剂(20%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、80%甲醇)进行超声提取，结果表明，没食子酸含量分别为0.132 8、0.142 8、0.173 3、0.157 3、0.135 3 mg/g，表明用50%甲醇作为提取溶剂的提取效果略优于其他溶剂，故选用50%甲醇作为提取溶剂。

3.3.3提取药液比的选择。选用不同提取药液比(1∶10、1∶25、1∶50、1∶80、1∶100)进行超声提取，结果发现没食子酸含量分别为0.229 0、0.159 8、0.151 9、0.158 4、0.148 0 mg/g，表明提取药液比为1∶10时没食子酸含量最高，提取效果最好，故采用提取药液比为1∶10。

3.3.4提取时间的选择。分别考察超声时间(20、30、40、60、90 min)对没食子酸的提取效果的影响，结果发现没食子酸含量分别为0.128 4、0.143 3、0.146 6、0.147 1、0.134 7 mg/g，表明超声60 min时提取效果略优于其他时间，故采用超声提取60 min。

因此该试验采用了“1.2.2”项下供试品溶液制备方法。

3.4 小结根据10批不同产地样品的测定结果，建议本品(按干燥品计算)含没食子酸(C7H6O5)不得少于0.02%。采用HPLC法，以没食子酸为指标性成分，可有效地控制白蔹药材的质量，且该方法重复性好，操作简便、灵敏、准确，为进一步制定白蔹药材的质量标准提供了科学依据。

[1] 江苏新医学院.中药大辞典，上册[M].上海：上海科技出版社，1977：691-692.

[2] 俞琦，蔡琨，田维毅.白敛醇提取物可影响免疫功能[J].中国医药报，2005，5(7)：20-21.

[3] 胡国臣.中药现代临床应用手册[M].北京：学苑出版社，1993：420.

[4] 宁俊华.单味白蔹治疗急、慢性菌痢疗效观[J].中西医结合杂志，1986，6(8)：500.

[5] 赫军，羡冀，宋莹莹，等.白蔹的化学成分[J].沈阳药科大学学报，2008，25(8)：636-638.

[6] 赫军，畅晓兵，杨旭，等.白蔹化学成分(II)[J].沈阳药科大学学报，2009，26(3)：188-190.

[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部(2010年版)[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录30.

[8] 孙立立，江波，袁振海，等.HPLC测定地榆饮片中没食子酸的含量[J].中成药，2006，28(8)：1144-1147.

[9] 曾翠兰，卢雪明.HPLC法测定丁香蓼药材中没食子酸的含量[J].湖南中医杂志，2013，29 (8)：130-131.

Determination of Gallic Acid in Prepared Slices ofAmpelopsisjaponicaby RP-HPLC

LE Jia-mei1,2, XIONG Xiao-juan2, BI Bao-bao3, LU Wen-quan1*

(1.Changzheng Hospital， Second Military Medical University, Shanghai 200003; 2. College of Chemical and Biological Engineering, Yichun University, Yichun, Jiangxi 336000; 3. School of Chemistry and Chemical Engineering, Henan University, Kaifeng, Henan 475000)

[Objective] To establish an RP-HPLC method for determination of gallic acid inAmpelopsisjaponica. [Method] The analysis was carried out on an Dikma Diamonsil C18column(250×4.6 mm, 5 μm)and the mobile phase was acetonitrile -0.2%phosophorie acid (3∶97) at the flow rate of 1.0 ml/min; the detection wavelength was 270 nm and the column temperature was 30 ℃. [Result] The linear range for gallic acid was 3.15-202 μg/ml (R2= 0.999 9 ). The average recovery was 102.8% (RSD= 1.15% ). [Conclusion] This method is simple, rapid, accurate, and it can be used for the quality control of the prepared slices ofAmpelopsisjaponica.

Ampelopsisjaponica; Gallic acid; RP-HPLC; Quality control

2015版中国药典项目“白蔹药材质量标准研究”。

乐佳美(1990- )，女，江西抚州人，硕士研究生，研究方向：天然药物活性成分与中药质量控制研究。*通讯作者，副主任药师，博士，硕士生导师，从事医院药学研究。

2014-12-15

S 567

A

0517-6611(2015)04-108-03