荷叶中4种黄酮类物质含量的测定

孙 敏， 刘嘉铭， 张丽萍*， 付大友， 谭文渊

(1.四川理工学院， 四川 自贡 643000； 2.四川大学 华西临床医学院, 四川 成都 610041)



荷叶中4种黄酮类物质含量的测定

孙 敏1， 刘嘉铭2， 张丽萍1*， 付大友1， 谭文渊1

(1.四川理工学院， 四川 自贡 643000； 2.四川大学 华西临床医学院, 四川 成都 610041)

为快速、简便地定性定量荷叶中的黄酮类物质，建立高效液相色谱法测定荷叶中金丝桃苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素4种黄酮含量的方法。结果表明：在其分析测定条件色谱柱为 Gemini C18，柱温为40℃，流动相为甲醇-0.1%磷酸(55∶45，体积比)，流速为1 mL/min，检测波长360 nm的条件下， 金丝桃苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量分别在1.5～48.0 μg/mL，1.0～32.0 μg/mL，1.0 ～32.0 μg/mL，0.7～24.0 μg/mL线性关系良好，方法的回收率为90%～103%，精密度为3.5%～4.2%，荷叶中4种黄酮含量依次为1.94%、0.092%、0.025%和0.016%。该方法可用于荷叶样品4种黄酮类物质的含量测定。

荷叶； 黄酮； 高效液相色谱

荷叶是一种常见的药食两用植物，所含化学活性成分主要有生物碱及黄酮类物质[1]。从荷叶中提取的黄酮类物质安全无害，是一种优良的黄酮潜在资源。2010版《中国药典》制定了荷叶中生物碱及荷叶碱含量测定方法，但未建立检测其黄酮成分的方法。

目前，关于黄酮成分测定方法已有报道[2-6]。其中，分光光度法[2]只能测定黄酮总量，而集分离和检测技术于一体的高效液相色谱法[3-6]则可在一定程度上对黄酮进行定性定量检测。如，2010版药典[5]采用高效液相色谱(HPLC)检测了银杏叶提取物黄酮中槲皮素、山奈酚和异鼠李素的含量，并以三者之和乘以适当系数作总黄酮含量。

不同植物、不同提取方法所得到的黄酮种类和含量不同，其药用价值也有明显差异。因此，充分了解荷叶提取物中黄酮的种类及含量十分必要。笔者通过质谱法确定了荷叶提取物中黄酮类物质主要有槲皮素、金丝桃苷、山奈酚和异鼠李素。由于质谱仪价格较贵，广泛应用受到一定限制，故借鉴文献[3-6]的研究思路，建立HPLC测定荷叶中金丝桃苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量的方法，以期为荷叶中黄酮类物质快速、准确的测定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

对照品金丝桃苷(HPLC,批号JS90090)、槲皮素(HPLC,批号JS90083)、山奈酚(HPLC,批号JS90129)、异鼠李素(HPLC,批号JS90190)均购于上海金穗生物科技有限公司，荷叶(产于四川成都)。

Agilent1200高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，Gemini C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，(广州菲罗门科学仪器有限公司)，质谱仪(安捷伦科技有限公司)，AUW120D电子分析天平(日本岛津公司)。

1.2 色谱条件的优化

1.2.1 检测波长的选择 分别取一定量的金丝桃苷、山奈酚、槲皮素和异鼠李素对照品溶液于10 mL的比色管中，用甲醇定容至刻度，在紫外可见分光度计上扫描，选择有最大吸收的波长为检测波长。

1.2.2 流动相体系的选择 分别对甲醇-0.1%磷酸和乙腈-0.1%磷酸两种流动相体系的配比进行考察，选择具有良好分离效果的体系为流动相。

1.2.3 流速的选择 试验考察了0.4 mL/min、0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min的分离效果，选择分离效果好的流速进样测定。

1.3 色谱条件

色谱柱：Gemini C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为40℃，以色谱条件优化的检测波长、流动相和流速进行测定，进样量为20μL。

1.4 对照与样品溶液的制备

1.4.1 对照 分别称取金丝桃苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素30.0 mg、20.0 mg、20.0 mg、15.0 mg标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到浓度分别为300 μg/mL、200 μg/mL、200 μg/mL、150 μg/mL的混合标液，置于冰箱中保存。

1.4.2 样品 荷叶在50℃下烘干至恒重，粉碎过60目筛，称取粉末5.0 g置于索氏提取装置中，用70%乙醇加热回流2 h，过滤弃滤渣，最后用乙醇定容于100 mL容量瓶中备用。

1.5 质谱法定性鉴定

将荷叶提取液用石油醚洗涤后，在负离子电离模式下采用全扫描方式测定，扫描范围：200～700 m/z。

1.6 标准曲线回归方程及相关指标测定

移取1.4中混合标液25 μL、50 μL、100 μL、200 μL、400 μL、600 μL、800 μL于5 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，按照1.2的方法操作，进样20 μL分析，以浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，测绘计算标准曲线的回归方程及相关指标。

1.7 系统适应性试验

分别取对照品溶液和样品溶液各20 μL按照优化的色谱条件进样测定。

1.8 方法学考察

1.8.1 系统精密度 移取混合标液20 μL，按照1.3测定相应含量，平行5次试验。

1.8.2 样品稳定性 移取样品溶液20 μL，按照1.3的方法操作，分别在0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h测定，记录峰面积，计算各成分含量。

1.8.3 加标回收率 称取5.0 mg荷叶粉末，加入一定量的标液，按照1.4.2处理样品，按照1.3测定相应含量，平行3次试验。

1.9 样品含量测定

按照1.4.2处理样品，按照1.3测定相应含量，平行5次试验。

2 结果与分析

2.1 质谱法定性鉴定

由图1可知，金丝桃苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素的质荷比依次为463、301、285、315。质谱图结果表明，荷叶提取液中含有金丝桃苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 检测波长 金丝桃苷、山奈酚、槲皮素和异鼠李素在波长为360 nm时均有较好吸收，故选择于波长360 nm处进行检测。

2.2.2 流动相体系 首先采用乙腈-0.1%磷酸等度洗脱条件进行检测，结果显示4种黄酮成分不能进行有效分离，故接着采用梯度洗脱程序进行一系列的流动相条件优化后，4种化合物虽然得到分离，但保留时间达到22 min左右，分析时间较长。最后采用甲醇-0.1%磷酸流动相体系进行研究，通过改变其流动相配比四种目标成分得到有效分离，在甲醇∶0.1%磷酸为55%∶45%时峰形较好，且保留时间在14 min左右，明显缩短了分析时间。

注：1为山奈酚， 2为槲皮素， 3为异鼠李素， 4为金丝桃苷

Note:1, isorhamnetin; 2, kaempferol; 3, quercetin; 4,hyperoside.

图1 荷叶提取液样品质谱图

Fig.1 The mass spectrum of lotus leaves extract

注：1为金丝桃苷， 2为槲皮素， 3为山奈酚，4为异鼠李素

Note:1, hyperoside; 2, quercetin; 3, kaempferol; 4,isorhamnetin.

图2 混合对照品(A)和样品(B)的HPLC色谱图

Fig.2 Chromatograms of reference substances (A) and samples(B)

2.2.3 流速 当流速小于1 mL/min时，保留时间较长；当流速大于1.0 mL/min时，保留时间虽然明显减小，但流速过大柱压太高会影响色谱柱的寿命。当流速为1.0 mL/min时，峰形较好保留时间适宜，故选其为该方法的流速。

2.2.4 系统适应性 由图2的色谱图计算得4种黄酮物质的理论塔板数均大于1000 0，色谱图中1、2、3、4分别代表的金丝桃苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素4种黄酮物质峰的分离度均大于1.5，且保留时间适宜，说明系统的适应性符合要求，即试验所选择的色谱操作条件符合定量分析要求。

2.3 标准曲线回归方程及相关指标测定

金丝桃苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素浓度分别在1.5～48.0 μg/mL、1.0～32.0 μg/mL、1.0～32.0 μg/mL、0.7～24.0 μg/mL线性关系良好，回归方程分别为y=21.388x+1.1625(R=0.999 9)、y=28.065x+7.519 1(R=0.999 9)、y=32.152x+6.994 2(R=0.999 9)、y=19.27 3x+1.421 2(R=0.999 8)。

2.4 样品含量测定

荷叶中金丝桃苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素的含量分别为1.94%、0.092%、0.025%和0.016%。相应RSD分别2.4%、3.2%、4.5%和3.9%，表明建立的方法重复性良好。

2.5 方法学考察结果

系统精密度：金丝桃苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量的RSD分别为1.5%、0.9%、1.0%、1.5%，表明高效液相色谱法的操作系统的精密度良好。

样品稳定性：金丝桃苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量的RSD依次为1.4%、3.0%、3.4%和2.4%，表明样品溶液在12 h内稳定。

表 高效液相色谱法测定荷叶中黄酮类物质的加标回收率

加标回收率：金丝桃苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素平均回收率依次为98.8%、99.3%、93.3%、93.3%，RSD依次为4.2%、4.1%、3.6%、3.5%(表)，表明测定方法可行。

3 结论

试验建立的高效液相色谱法，在色谱柱：Gemini C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm )；流动相：A为甲醇(55%)，B为0.1%磷酸水溶液(45%)，流速为1 mL/min，柱温：40℃，进样量：20 μL条件下可同时测定荷叶中金丝桃苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素4种成分，方法的精密度为1.8%～2.5%，回收率为94.3%～101.3%，样品中金丝桃苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量依次为1.94%、0.092%、0.025%、0.016%。说明该方法简便，准确，重复性好，可用于荷叶提取物的质量控制。

[1] 赵小亮,王智民,马小军,等.荷叶化学成分研究[J].中国中药杂志,2013,38(5):703.

[2] 邓胜国,邓泽元,范亚苇.紫外分光光度法测定荷叶总黄酮含量[J].南昌大学学报:理科版,2008,32(2):148-150.

[3] 党 军,张兴旺,陶燕铎.高效液相色谱法测定野葱中黄酮类化合物[J].化学研究与应用,2012,2(2):282-286.

[4] 周兰香,黄阿根.分光光度与HPLC法测定荷叶总黄酮的研究[J].中草药,2002,33(1):35.

[5] 赵艳波,施晓光.高效液相色谱法测定荷叶中总黄酮量[J].中国医院药学杂志.2010,30(20):1795.

[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:化学工业出版社,2010.

(责任编辑：孙小岚)

Determination of Four Kinds of Flavonoids in Lotus Leaves

SUN Min1， LIU Jiaming2, ZHANG Liping1*， FU Dayou1， TAN Wenyuan1

(1.SichuanUniversityofScience&Engineering.Zigong643000,Sichuan,China; 2.WestChinaSchoolofMedicine,SichuanUniversity.Chengdu610041,China)

To establish a quick and easy method of qualitative and quantitative analysis for determining the content of hyperoside, quercetin, kaempferol and isorhamnetin in lotus leaves by HPLC.Results: Under conditions of Gemini C18 for the chromatographic column and 40℃ for column temperature, with methanol-0.1% phosphoric aicd(55∶45，v∶v)of the mobile phase and 1 mL/min of flow velocity, 360nm for the detection wavelength, the linear ranges of hyperoside, quercetin, kaempferol and isorhamnetin were 1.5～48.0 μg/mL,1.0～32.0 μg/mL, 1.0～32.0 μg/mL,0.7～24.0 μg/mL, respectively, the recovery was 90%～103% and the precision was 3.5%～4.2%, the contents of four kinds of flavonoids in lotus leaves were respectively 1.94%, 0.092%, 0.025% and 0.021%. The proposed method was suitable for the determination of hyperoside, quercetin,kaempferol and isorhamnetin in lotus leaves.

lotus leaves; flavonoids; HPLC

2014-11-19； 2015-04-19修回

四川省中医药管理局科研项目“荷叶黄酮提取、分离和测定方法构建及其体外抗前列腺癌作用研究”(2014-K-114)

孙 敏(1988-)，女，在读硕士，研究方向：分析检测及提取方法。E-mail:sunmin723@163.com

*通讯作者:张丽萍(1964-)，女，教授，从事分析检测及提取方法的研究工作。E-mail: zlp666111@126.com

1001-3601(2015)05-0240-0072-03

R284.3

A