传统活性污泥法和膜生物反应器驯化期微生物群落组成特征

李安峰，骆坚平，黄 丹，潘 涛

(北京市环境保护科学研究院国家城市环境污染控制工程技术研究中心，北京 100037)



传统活性污泥法和膜生物反应器驯化期微生物群落组成特征

李安峰，骆坚平，黄 丹，潘 涛

(北京市环境保护科学研究院国家城市环境污染控制工程技术研究中心，北京 100037)

[目的]比较传统活性污泥法(S1)和膜生物反应器(MBR,S2)工艺微生物群落之间的差异。[方法]通过MiSeq高通量测序平台，分析处于驯化期的S1和S2工艺中微生物群落结构组成。[结果]从S1和S2分别获得47 354和51 882条有效序列，平均长度为253 bp。在97%相似性水平下，从S1和S2分别可确定2 693和3 208个操作分类单元(OTU)，其中有1 156个OTU为相同单元。S1和S2的丰度指数(Chao 1)分别为6 639.3和9 564.1，Shannon指数为9.03和9.13。系统进化分析结果表明，两种处理系统中活性污泥的优势菌群均为变形菌门(Proteobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)；同时，硝化螺旋菌门(Nitrospirae)在MBR中更易富集，所占比例要高于传统活性污泥法。[结论]在驯化期中，MBR和传统活性污泥法均具有较高的微生物多样性以及相似的优势菌群结构。由于对微生物的高效过滤作用，驯化期MBR中微生物群落多样性更为丰富。

传统活性污泥法；膜生物反应器；高通量；微生物群落

污水处理系统中，驯化期是微生物群落对环境因子和操作条件处于逐渐适应的阶段，与稳定运行期相比，微生物群落结构存在显著的差异[1-2]。因而，了解处于驯化期污水处理系统的微生物组成对于工艺的设计、调试和稳定运行具有指导意义。然而，污水处理系统中微生物群落是极其复杂的。由于能够被纯培养的微生物在环境中的比例只有0.1%～10.0%，因此采用传统纯培养技术进行污水处理系统的微生物群落结构分析局限性较大，无法获取足够的微生物信息[3]。20世纪90年代以来，以核酸技术为主要内容的分子生物学技术，例如原位荧光杂交法(FISH)、聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳(PCR-DGGE/TGGE)、末端标记限制性片段长度多态性(T-RFLP)、16S rRNA克隆文库构建、实时PCR等，极大地克服了微生物传统培养法的不足，可以在分子水平评价群落多样性，揭示生物与环境之间的作用机制等[4-5]。Rosenkran等通过DGGE分析发现，当进水苯酚浓度从120 mg/L增加到800 mg/L时，厌氧序批式反应器中微生物群落结构并没有明显变化，但是当苯酚进水浓度从800 mg/L上升到1 200 mg/L时，微生物群落结构发生了急剧变化，其中优势菌由Spirochaetaceae、Anaerolineaceae变为Anaerolineaceae[6]。通过T-RFLP对A/O-MBR系统微生物群落进行分析，发现不同膜污染时期，好氧池中微生物结构也随着变化，在膜污染初期，好氧池中微生物以Thiothrixsp.为主；当膜污染加剧时，Zoogloearamigera则取代Thiothrixsp.成为优势菌种[7]。DGGE结果表明，利用不同接种污泥而相同厌氧工艺处理奶酪厂生产废水时，污泥微生物群落结构表现出高度一致性[8]。但是，这些技术由于存在操作引起的误差大、步骤繁杂等问题，为其应用带来了许多限制[9-10]。

近年来，作为第二代测序技术的高通量测序得到了快速的发展和应用，如454焦磷酸高通量测序、MiSeq高通量测序等。高通量测序技术一次可以对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序，可以对物种的转录组和基因组进行全貌分析[11-12]。Hu等采用454焦磷酸高通量测序技术对不同MBR污水处理系统的微生物群落结构分析发现，有些污水厂活性污泥中Proteobacteria为优势菌种，而有些污水厂活性污泥中则以Bacteroidetes为主，并且通过Sørensen相似性指数及主成分分析发现，微生物群落结构总体相似性不是很高[13]。笔者通过MiSeq高通量测序平台，对驯化期MBR以及传统活性污泥法工艺的微生物群落结构进行分析，为工艺的调试和优化提供微生物学方面的信息。

1 试验材料与方法

1.1 试验装置该试验采用好氧平板式MBR以及传统活性污泥法处理小区生活污水。反应器有效容积均为120 L，试验过程中溶解氧均控制在2 mg/L左右。MBR和传统活性污泥法均处于驯化期，驯化时间2个月。其中，MBR膜组件有效膜面积为1 m2，材质为聚偏氟乙烯(PVDF)，孔径<0.1 μm，购自上海斯纳普公司。MBR抽停比为6∶2，污泥浓度为4 g/L，HRT为8 h。传统活性污泥反应器MLSS为1.5 g/L左右，HRT=8 h。小区生活污水进水COD、TN分别在200～800，50～120 mg/L之间波动，该试验接种污泥均取自某污水处理厂二沉池所排出的剩余污泥。

1.2 主要试剂及仪器Omega土壤DNA小量提取试剂盒(美国Omega公司)；Nanodrop ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计(美国Thermo Fisher公司)；CFX 96实时定量PCR仪(美国BIORAD公司)；离心柱型超薄琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；Illumina MiSeq测序仪(美国Illumina公司)；引物合成、MiSeq高通量测序和生物信息学分析由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.3 微生物多样性分析

1.3.1DNA提取与PCR扩增。分别提取传统活性污泥反应器(S1)和MBR(S2)中的污泥混合液。首先利用Omega土壤DNA小量提取试剂盒提取两组样品的DNA，DNA的浓度与纯度利用分光光度法检验。其中，DNA浓度通过测定其在260 nm下吸光度确定；DNA纯度通过比较260 nm/230 nm(DNA/腐殖酸)和260 nm/280 nm(DNA/蛋白质)的值确定。PCR扩增区域选择样本16S rRNA的V4区域，16S rRNA引物序列为515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR反应体系以1 μl DNA为模板，扩增条件：98 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行35个循环；35个循环之后，72 ℃延伸5 min。利用超薄琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物，并用2%(w/v)的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.3.2MiSeq高通量测序。使用Illumina的MiSeq测序仪，对16S rRNA的PCR产物进行双端测序。使用QIIME软件对测序数据进行过滤。通过flash软件将有overlap的一对reads进行拼接。

1.3.3生物信息学分析。根据序列的相似性，在97%相似水平下，利用uparse软件将序列归为多个OTU(操作分类单元)。根据OTU数据，做出每个样品的稀释曲线，同时计算各个样品的相关分析指数，包括丰度指数(Chao 1)、多样性指数(Shannon指数)。另外，根据相关数据进行主成分、OTU分布Venn图、Rank-Abundance曲线以及门水平的样品群落结构的分析。

2 结果与分析

2.1 样品序列数目通过对活性污泥样品16S rRNA基因文库MiSeq测序，从传统活性污泥法污泥混合液样品(S1)和MBR污泥混合液样品(S2)各获得47 354和51 882条有效序列，序列平均长度为253 bp。将序列与Silva库进行比对聚类分析，在97%相似水平下，从S1和S2中分别得到的OTU数目为2 693和3 208，并共有1 156个OTU(图1)。这表明在驯化期中传统活性污泥法和MBR均具有较高的微生物多样性，而且MBR中的多样性可能更丰富。

2.2 主成分分析从图2可知，与污泥混合液细菌群落结构相关的有关主成分中，P1主成分的方差贡献率为15.45%，P2主成分的方差贡献率为11.97%。S1和S2所代表的点距离相近，这表明S1和S2所代表的菌群结构存在一定差异，但不是很大，这与上述两个系统中OTU的分布相吻合。

2.3 Rank-Abundance曲线图3为S1和S2样品的Rank-Abundance(相对丰度)曲线。Rank-Abundance曲线用于同时解释样品多样性的两个方面，即样品所含物种的丰富程度和均匀程度。物种的丰富程度由曲线在横轴上的长度，即OTU数来反映，曲线越宽，表示物种的组成越丰富，结果与OTU分布Venn图分析一致。物种组成的均匀程度由曲线的形状来反映，曲线越平坦，表示物种组成的均匀程度越高。对比S1和S2的曲线可知，S1和S2的曲线的形状均不太平坦，这意味着S1和S2中微生物群落物种的分布均匀程度不高。

2.4 微生物群落多样性分析为了研究污泥混合液中微生物群落多样性，选取群落丰度指数(Chao 1指数)、多样性指数(Shannon指数)为参考标准。在97%和95%的相似水平下，S1的Chao 1指数为6 639.3/2 904.5，Shannon指数为9.03/8.23;S2的Chao 1指数为8 564.1/3 819.5，Shannon指数为9.13/8.27。驯化期中MBR污泥混合液的群落多样性高于传统污泥法污泥混合液样品，而且MBR和传统活性污泥法反应器中Shannon指数(97%)均高于之前报道[13-15]。一般认为，处于稳定运行期的MBR的SRT较长，F/M较低，污泥浓度较高，这些条件更利于适应性强的菌落富集，因而MBR中微生物群落多样性(Simpon指数)要低于普通A/A/O、A/O工艺[13]。但在该研究中，由于污水处理系统均处于驯化期，反应器中微生物还处于增长阶段，MLSS仍具有较大的上升空间，此时不同的微生物正在对系统条件进行适应性变化，会表现出较高的多样性[16]。同时，MBR的高效过滤作用使得这种多样性在这一时期可以得到更多的保留。当然，当环境因素和操作条件对微生物的定向选择完成后，系统进入稳定期，此时微生物群落结构组成稳定，种群数量较接种时期大为减少[17-18]。

2.5 样品群落结构分析从门分类水平的群落分析表明(图4)，S1和S2均由11个门以及其他未知的菌类组成，其中变形菌门(Proteobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、绿弯菌门(Chloroflexi)和厚壁菌门(Firmicutes)共占85%以上，其余部分如放线菌(Actinobacteria)、泉古菌门(Crenarchaeota)、广古菌门(Euryarchaeota)、螺旋体门(Spirochaetes)、热袍菌门(Thermotogae)以及其他一些未知菌种仅占15%左右。在S1和S2中，变形菌门所占比例最大，主要功能为去除水中有机物[19]，其次为拟杆菌门、浮霉菌门。优势菌与之前的研究结果基本一致，不过次优势菌略有差异[20-21]。从门分类水平而言，传统活性污泥法工艺和MBR工艺中微生物群落结构相似，无显著性差异。之前也有类似的报道，同一废水处理系统不同运行工艺(A2O和倒置A2O、MBR和传统活性污泥法)的微生物群落结构有高度的相似性，这可能跟相同的进水水质有很大的关系[22-23]。另外，S2中未知菌类所占比例更高，这与S2中生物多样性更丰富的结论是一致的。

众所周知，由于MBR工艺可以实现水力停留时间和污泥龄的完全分离，MBR工艺更有利于世代周期长的硝化菌的截留与生长。该研究中，通过对比也发现了该类现象，S2中硝化螺旋菌门比例要高于S1。

3 总结

处于驯化期的MBR和传统活性污泥处理系统中均具有较高的微生物多样性，而且由于MBR的高效过滤作用，其微生物群落多样性更为丰富。在门分类水平上，两种处理系统中活性污泥具有相似的优势菌群结构，优势菌群均为变形菌门、浮霉菌门、拟杆菌门；同时，硝化螺旋菌门在MBR中更易富集，所占比例要高于传统活性污泥法。

[1] 邢德峰，任南琪，宫曼丽.PCR-DGGE技术解析生物制氢反应器微生物多样性[J].环境科学，2005，26(2):172-176.

[2] 朱铁群，李凯慧，张杰.活性污泥驯化的微生物生态学原理[J].微生物学通报，2008，35(6):939-943.

[3] 张昱，王振宇，杨敏.环境净化中的微生物生态学[J].化工进展，2009，21(2/3):565-569.

[4] YE L，ZHANG T.Estimation of nitrifier abundances in a partial nitrification reactor treating ammonium-rich saline wastewater using DGGE，T-RFLP and mathematical modeling[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2010，88(6):1403-1412.

[5] LEFEBVRE O，NGUYEN HTT，AL-MAMUN A，et al.T-RFLP reveals high β-Proteobacteria diversity in microbial fuel cells enriched with domestic wastewater[J].Journal of Applied Microbiology，2010，109(3):839-850.

[6] ROSENKRAN F，CABROL L，CARBALLA M，et al.Relationship between phenol degradation efficiency and microbial community structure in an anaerobic SBR[J].Water Research，2013，47(17):6739-6749.

[7] GAO DW，WEN ZD，LI B，et al.Microbial community structure characteristics associated membrane fouling in A/O-MBR system[J].Bioresoure Technology，2014，154:87-93.

[8] KIM J，LEE S，LEE C.Comparative study of changes in reaction profile and microbial community structure in two anaerobic repeated-batch reactors started up with different seed sludges[J].Bioresoure Technology，2013，129:495-505.

[9] 李桥，王龙龙.454高通量测序技术在土壤微生物中的应用[J].绿色科技，2013(8):202-204.

[10] 孙庆华，柏耀辉，赵翠，等.DGGE，T-RFLP，LH-PCR对两种活性污泥的微生物种群多样性分析的比较[J].环境工程学报，2009，3(8):1365-1370.

[11] 金迪，王加启，赵圣国，等.元转录组学在微生物群落研究中的应用[J].微生物学通报，2012，39(2):237-245.

[12] CAPORASO JG，LAUBER CL，WALTERS WA，et al.Ultra-high-throughout microbial community analysis on the Illumina Hiseq and MiSeq platforms[J].International Society for Microbial Ecology，2012，6(8):1621-1624.

[13] HU M，WANG XH，WEN XH，et al.Microbial community structures in different wastewater treatment plants as revealed by 454-pyrosequencing analysis[J].Bioresoure Technology，2012,117:72-79.

[14] MA JX，WANG ZW，YANG Y，et al.Correlating microbial community structure and composition with aeration intensity in submerged membrane bioreactors by 454 high-throughout pyrosequencing[J].Water Research，2013，47(2):859-869.

[15] 唐霁旭，王志伟，马金星，等.454高通量焦磷酸测序法鉴定膜生物反应器膜污染优势菌种[J].微生物学通报，2014(2)：187-194.

[16] 胡怡杉，孙宝盛，王盛勇.MBR和CAS工艺污泥在贫营养培养条件下的微生物群落结构研究[J].环境科学学报，2011，31(9):1900-1907.

[17] 张斌，孙宝盛，季民，等.MBR中微生物群落结构的演变与分析[J].环境科学学报，2008，28(11):2192-2199.

[18] 于凤庆，孙宝盛，陈谊，等.MBR活性污泥培养驯化过程中生物多样性研究[J].环境科学学报，2012，32(9):2084-2090.

[19] WANGER M，AMANN R，LEMMER H，et al.Probing activated sludge with oligonucleotides specific for Proteobacteria:inadequacy of culture-dependent methods for describing microbial community structure[J].Applied and Environmental Microbiology，1993，59(5):1520-1525.

[20] WANG XH，HU M，XIA Y，et al.Pyrosequencing analysis of bacterial diversity in 14 wastewater treatment systems in China[J].Applied and Environmental Microbiology，2012，78(19):7042-7047.

[21] SANAPAREDDY N，HAMP TIMOTH JT，GONZALEZ CL，et al.Molecular diversity of a north Carolina wastewater treatment plant as revealed by pyrosequencing[J].Applied and Environmental Microbiology，2009，75(6):1688-1696.

[22] HESHAM AE，QI R，YANG M.Comparison of bacterial community structures in two systems of a sewage treatment plants using PCR-DGGE analysis[J].Journal of Environmental Sciences，2011，23(12):2049-2054.

[23] MIURA Y，HIRAIWA NM，ITO T，et al.Bacterial community structures in MBRs treating municipal wastewater:relationship between community stability and reactor performance[J].Water Research，2007，41(3):627-637.

Microbial Community Characteristics of Traditional Activated Sludge Process and MBR in Acclimation Period

LI An-feng, LUO Jian-ping, HUANG Dan et al

(National Engineering Research Center for Urban Environmental Pollution Control, Beijing Municipal Research Institute of Environmental Protection, Beijing 100037)

[Objective] To compare the microbial community characteristics in a traditional activated sludge process (S1) and membrane bio-reactor (MBR, S2). [Method] MiSeq high-throughput sequencing was used to investigate the microbial community characteristics in S1 and S2. [Result] The results showed that 47 354 and 51 882 reads with an average read length of 253 bp were found from S1 and S2, respectively. At the similarity level of 97%, 2 693 and 3 208 operational taxonomic units (OTUs) were obtained from S1 and S2, respectively, and number of common OTUs was 1 156. The richness index (Chao 1) of S1 and S2 were 6 639.3 and 9 564.1, and Shannon index were 9.03 and 9.13, respectively. In addition, Analysis of system evolution demonstrated that Proteobacteria, Planctomycetes and Bacteroidetes were the dominant phylum in both S1 and S2. Morever, the nitrifying bacteria could be enriched more effectively in MBR, and the ratio of Nitrospirae was higher in comparison with that in the traditional activated sludge process. [Conclusion] In acclimation period, both traditional activated sludge process and MBR had very high microbial community diversity, and similar microbial community structure at phylum level. Higher diversity could be found from MBR in acclimation period due to its efficient filtration.

Traditional activated sludge process; MBR; High-throughput sequencing; Microbial community

北京市环境保护科学研究院科技基金项目(2013A07)。

李安峰(1974-)，男，山东泰安人，副研究员，博士，从事水污染控制研究。

2014-11-21

S 181.3

A

0517-6611(2015)01-189-03