黑粉病菌对薏苡生长及其细胞壁降解酶活性变化的影响

莫熙礼， 吴彤林， 李松克， 李本华， 江厚成， 武华文

(黔西南民族职业技术学院， 贵州 兴义 562400)



黑粉病菌对薏苡生长及其细胞壁降解酶活性变化的影响

莫熙礼， 吴彤林， 李松克， 李本华， 江厚成， 武华文

(黔西南民族职业技术学院， 贵州 兴义 562400)

为了解薏苡黑粉病菌的致病性机制，对种子接种黑粉病菌后的发芽率和幼芽生长抑制作用、黑粉病菌在薏苡不同生长期的侵入危害及接种黑粉病菌后薏苡种子分泌产生的角质酶、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖酸酶(PG)、β-1,4-内切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶的活性变化进行测定。结果表明：黑粉病菌对种子的发芽无抑制作用，对幼芽的生长有一定的抑制作用；接种黑粉病菌孢子后，种子发病率为75.7%，而叶片和穗部的发病率都低于10%；病原菌处理种子后，角质酶的活性在6 h和12 h出现峰值，略高于对照，其余时间角质酶活性与对照差异不明显，且角质酶的含量和活性均较低；细胞壁降解酶的活性测定发现，种子接触黑粉病菌后，果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性与对照的PMG活性差异不显著，且活性的变化率相同；多聚半乳糖酸酶(PG)、β-1,4-内切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶的活性在24 h内迅速升高，达到峰值，之后迅速下降，与健康植株(CK)的活性差异不显著，且变化规律相同。

薏苡; 黑粉病; 发病率; 种子发芽率; 幼芽生长抑制; 细胞壁降解酶活性

薏苡黑粉病是一种真菌性病害，由薏苡黑粉菌属黑粉病菌(Ustffagocoic-sbref)引起，是我国薏苡生产上危害最重的病害之一，可使产量下降30%～50%，严重时减产80%。近年来，随着我国薏苡种植规模的扩大，薏苡黑粉病大面积频繁发生，而且呈逐年上升趋势，已成为薏苡生产的重要制约因素。目前，国内外有关薏苡黑粉病的发生规律、生物学特性、致病机制等方面的研究尚未见报道，仅在防治方面有部分报道[1-3]。角质层和细胞壁是植物病原菌成功入侵植物需克服的两道屏障，植物病原物则是通过合成和分泌各种细胞壁降解酶，降解植物体表的角质，降低植物自身的防御能力，利于病原菌的侵入[4-5]。笔者从薏苡黑粉病菌的侵入时期、侵入部位以及病菌产生的角质酶、果胶酶、纤维素酶的活性分析等方面，研究黑粉病菌的侵入关键时期、关键部位以及病原菌分泌产生各类致病相关酶在致病过程中所起的作用，为研究薏苡黑粉病菌的致病性机制以及薏苡黑粉病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

薏苡品种为晴薏白03-6，由黔西南民族职业技术学院吴彤林教授提供。

薏苡黑粉病菌采集于黔西南州农作物科学研究所薏苡示范基地。在薏苡果实上采集分离得到病瘤，风干后存放于纸盒内，于4℃冰箱保存备用。使用前将病瘤碾碎并过40目筛，得到菌粉，用蒸馏水将菌粉配成厚垣孢子浓度为1×104的悬浮液备人工接种。

1.2 种子发芽率和幼芽生长试验

薏苡种子经5%石灰水浸种24 h后，取出用清水清洗干净并晾干。将种子放入双层滤纸的大培养皿中培养，用1×104孢子悬浮液喷雾种子，喷雾量为滤纸湿透，以蒸馏水为对照。将培养皿置于25℃黑暗恒温箱中培养48 h(露白)后统计种子发芽数，计算萌发率。露白后，将培养皿放入25℃的光照培养箱内培养48 h，并测量幼芽的长度，每次随机测量10颗种子幼芽的长度，每个处理5次重复。

发芽率=(发芽种子数/测定总种子数)×100%

1.3 黑粉病菌对薏苡不同生育期的侵入试验

薏苡接菌时间设3个处理(时期)，分别为种子露白期、薏苡4叶期和薏苡抽穗期。处理1(种子+接菌)，薏苡种子经5%石灰水浸种24 h，取出用清水清洗干净并晾干，放入有双层滤纸的大培养皿中，置于25℃黑暗恒温箱中培养48 h，露白后接种浓度为1×104的孢子悬浮液，接种的量以全部种子表面形成水膜为宜。处理2(叶片+接菌)，薏苡4叶期接种浓度为1×104的孢子悬浮液，喷施的量以全部叶片上刚形成水滴为宜。处理3(抽穗+接菌)，在薏苡抽穗期接种浓度为1×104的孢子悬浮液，喷施的量以穗部刚形成水滴为宜。各处理均以清水作对照(CK)，每处理3次重复。收获期统计各处理黑粉病的发病株数，并计算发病率。

发病率=(发病的株数/各处理的总株数)×100%

1.4 种子接菌处理后细胞壁降解酶活性的变化试验

1.4.1 角质酶 称取1 g处理后的种子，加入4 mL的角质酶提取液，冰浴研磨，4℃,1 000 r/min离心10 min，取上清液即为角质酶的粗提取液。角质酶提取液配制及角质酶活性的测定参考吴洁云[6]的方法，分别测定处理后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h角质酶活性的变化。以1 mg酶蛋白1 min内吸光值为酶单位(U/mg)。

1.4.2 果胶酶 酶粗液的提取方法同1.4.1，果胶酶提取液的配制、多聚半乳糖酸酶(PG)以及果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性的测定参考李宝聚[7]的方法。分别测定处理后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h多聚半乳糖酸酶(PG)以及果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性的变化。50℃酶解30 min，以1 h/mg蛋白催化底物产生1 μmol还原糖所需的酶量(U/mg)为1个酶活力单位。

1.4.3 纤维素酶 酶粗液的提取方法同1.4.1。纤维素酶提取液的配制、β-1,4-内切葡聚糖酶(EG)活性和β-葡聚苷酶的活性的测定参考董小梅[8]的方法。分别测定处理后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h β-1,4-内切葡聚糖酶(Cx)活性和β-葡聚苷酶活性的变化。50℃酶解30 min，以1 h/mg蛋白催化底物产生1 μmol还原糖所需的酶量(U/mg)为一个酶活力单位。

以上试验均以牛血清蛋白作标准曲线。

2 结果与分析

2.1 黑粉病菌对薏苡的发芽率和幼芽生长的影响

由表1看出，黑粉病菌孢子悬浮液处理后，种子的发芽率为87.21%，与清水对照相比差异不显著。而病菌孢子悬浮液处理后，幼芽的生长长度为17.35 cm，明显低于清水对照。说明，黑粉病菌对薏苡种子的发芽率无影响，而对幼芽生长有一定的抑制作用。

表1 黑粉病菌孢子悬浮液处理薏苡的发芽率和幼芽长度

Table 1 Germination rate and bud length of Coix lacrymajobi withUstffagocoic-sbrefspore suspension

项目Items发芽率/%Germinationrate幼芽长度/cmBudlength黑粉病菌Ustffagocoic-sbref87.2117.35清水(CK)Clearwater89.5619.54

2.2 黑粉病菌在薏苡不同生育期的侵入情况

从表2看出，黑粉病在薏苡生长的不同时期其危害程度不同。其中，种子+接种黑粉病菌孢子处理的薏苡黑粉病在抽穗期的发病率达75.7%，而叶片+接菌和抽穗+接菌处理的发病率均低于10%。表明，薏苡黑粉病菌主要为种子侵入，不能或很少从叶片和穗部侵入危害。

表2 薏苡不同生育期接种黑粉病菌后的发病率

图示 接种黑粉菌后种子角质酶、多聚半乳糖酸酶、果胶甲基半乳糖醛酸、β-1,4-内切葡聚糖酶和β-葡聚苷酶的酶活

Fig. Cutinase, polygalacturonase (PG), polymethyl galacturonate (PMG), β-1,4-endoglucanase(Cx) and β-galactosidase activity of Coix lacrymajobi seeds inoculated withUstffagocoic-sbref

2.3 接菌后薏苡种子细胞壁降解酶活性的变化

由图示看出，种子接菌后：1) 角质酶。种子角质酶的活性在6 h和12 h出现峰值略高于对照，其余时间差异不明显。在整个检测周期，角质酶的含量和活性都较低。说明，角质酶在薏苡黑粉病菌的侵入过程中可能不起作用。2) 细胞壁果胶酶。多聚半乳糖酸酶(PG)活性能迅速升高，在24 h达到峰值，以后逐渐下降，且活性显著高于对照。说明，PG酶在黑粉病菌侵入薏苡过程中起重要作用。果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性在6 h出现，之后逐渐的下降，但变化幅度小，与对照间差异不显著，且活性的变化率相同。由此推断，PMG酶在黑粉病菌侵入薏苡幼芽过程中起的作用可能较小。3) 纤维素酶。种子接菌后，β-1,4-内切葡聚糖酶(Cx)活性在12 h时迅速升高，显著高于对照，之后逐渐下降，且变化规律与对照相同；对照的β-1,4-内切葡聚糖酶活性在整个检测阶段无显著的变化。由此判断，β-1,4-内切葡聚糖酶在黑粉病菌侵入薏苡幼芽后12 h起重要的作用。种子接菌后，β-葡聚苷酶的活性迅速升高，在24 h达峰值，此后下降与对照的β-葡聚苷酶活性相差不大。说明，β-葡聚苷酶在黑粉病菌侵入种子幼芽24 h内起重要作用。

3 结论与讨论

1) 黑粉病主要危害薏苡的幼芽，侵染时期限于二叶期之前，芽生长长度超过20 cm后，其危害的几率迅速下降[9]。本试验结果也表明，孢子悬浮液对种子的发芽无抑制作用，对幼芽的生长具有一定的抑制作用。种子接触黑粉病菌孢子后，收获时期薏苡果实的黑粉病发病率为75.7%，而叶片和穗部接触病菌孢子后，引起薏苡黑粉病发病率都低于10%。因此，判断薏苡黑粉病菌主要从种子侵入危害，不能或很少能从叶片和穗部入侵。

2) 角质层是阻止病原真菌侵入寄主植物的第一道屏障，很多植物病原菌通过合成和分泌角质酶迅速降解寄主植物的角质，降低其防御能力，以达到侵害目的[2]，且病原物的致病性与角质酶的表达量呈正相关[10]。本研究发现，病原菌处理种子后，角质酶的活性在6 h和12 h出现峰值略高于对照，其余时间角质酶活性与对照差异不明显，且角质酶的含量和活性都较低。低含量和低活性的角质酶可以冲破幼芽薄薄的一层角质层，侵入到薏苡的幼芽组织中。而出土后的薏苡叶片和穗部表面的角质层较厚，且常常附有一层蜡质层，因此，低浓度和低活性的角质酶不能冲破这一道屏障。这可能是黑粉病菌不能或很少能侵入薏苡的叶片和穗部的原因。

3) 植物病原真菌要成功地侵入寄主植物，必须刺穿细胞壁，即病原真菌侵入的第二道屏障。很多植物病原真菌通过分泌细胞壁降解酶降解细胞壁(果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖酸酶(PG)、β-1,4-内切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶)，从而达到危害寄主植物的目的[3]。本研究对细胞壁降解酶活性的测定发现，种子接触黑粉病菌后，果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性与对照的PMG活性差异不显著，且活性变化率相同，这可能是PMG在黑粉病菌侵入幼芽过程中不起作用；而多聚半乳糖酸酶(PG)、β-1,4-内切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶的活性在24 h内迅速升高达到峰值，之后迅速的下降与健康(CK)的植株的活性差异不显著，且变化规律相同。说明黑粉病菌24 h内大量分泌各种细胞壁降解酶破坏组织细胞壁侵入寄主细胞，且侵入薏苡幼芽后，并没有短时间内迅速破坏寄主组织或者从组织中获取大量的养分，而是与幼嫩的组织共存，随着生长点向上移动,这可能是种子感染黑粉病菌后，叶片很少发现病症，而穗部的症状很严重的原因。其作用方式和作用机理有待更深一步的研究。

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(责任编辑： 聂克艳)

Effects ofUstffagocoic-sbrefon Growth and Cell Wall Degrading-enzyme Activity ofCoixlacrymajobi

MO Xili, WU Tonglin, LI Songke, LI Benhua, JIANG Houcheng, WU Huawen

(QianxinanVocationalandTechnicalCollegeforNationality,Xingyi,Guizhou562400,China)

The activity of cutinase and cell wall degrading enzymes (polymethyl galacturonase PMG, polygalacturonase PG, β-1,4-endoglucanase Cx and β-galactosidase) ofCoixlacrymajobiseeds inoculated withUstffagocoic-sbrefwas detected to understand the pathogenicity mechanism and study effects ofUstffagocoic-sbrefon seed germination rate and bud growth. The results showed thatUstffagocoic-sbrefhas no inhibition effect on seed germination and a certain inhibition effect on bud growth. The disease rate ofCoixlacrymajobiseeds inoculated withUstffagocoic-sbrefis 75.7% but disease rate ofUstffagocoic-sbrefleaves and spikes is lower than 10%. The cutinase activity ofCoixlacrymajobiseeds inoculatedUstffagocoic-sbrefreaches the peak value after 6 h and 12 h respectively, slight higher than CK. There is no obvious difference in cutinase activity but the cutinase content and activity both are lower during other time. PMG activity ofCoixlacrymajobiseeds inoculated withUstffagocoic-sbrefis no difference with CK and the variation rate of PMG activity ofCoixlacrymajobiseeds inoculated withUstffagocoic-sbrefand CK is the same. The PG, Cx and β-galactosidase activity ofCoixlacrymajobiseeds inoculated withUstffagocoic-sbrefreaches the peak rapidly within 24 h, then drops rapidly and finally is no difference with healthy plants of CK.

Coixlacrymajobi;Ustffagocoic-sbref; disease rate; seed germination rate; growth inhibition; young buds; activity of cell wall degrading-enzyme

2014-12-18； 2015-06-22修回

贵州省星火计划项目“薏苡标准化栽培技术示范推广”[黔科合农字(2013)5035];贵州省科技计划项目“贵州省薏苡工程技术研究中心” [黔科合农字(2012)11]

莫熙礼(1982-)，男，讲师，硕士，从事植物病虫害防治教学和研究。E-mail:moxili1982@163.com

1001-3601(2015)07-0367-0080-03

S436.6

A