猪伪狂犬病病毒gE基因核酸探针的制备

刘志杰

（山东青岛即墨市畜牧兽医局，山东即墨 266200）

猪伪狂犬病病毒gE基因核酸探针的制备

刘志杰

（山东青岛即墨市畜牧兽医局，山东即墨 266200）

猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的一种以发热、呼吸和神经系统疾病为特征的重要传染病，国内到目前为止，已经有20多个省市报道有伪狂犬病流行，并分离出MinA、陕A、AKW、DQ-8401、S、鄂A、京A等多株猪伪狂犬病病毒（PRV）。OIE推荐使用基因缺失疫苗，我国农业部已决定只生产和使用基因缺失疫苗，目前已经商业化基因缺失疫苗普遍缺失了gE基因，本文报道了利用缺失的gE基因制备核酸探针的研究。

1 材料与方法

1.1 病毒与细胞

PRV-S国内分离株；PPV、PCV、PRRSV、CSFV、Vero细胞、大肠杆菌DH5α；PRV Bartha-k61株疫苗。

1.2 主要试剂

pMD-18T-Vector线状克隆载体、Taq DNA聚合酶和DNA纯化回收试剂盒、TRIZOL试剂盒、Dig标记及检测试剂盒。

1.3 引物

PS5’－ACG ACG ATG ACC TCA ACG G－3'，PR5'－AGG TAG TCG CCG ATG CCC －3'。

1.4 病毒增殖

PRV -S株及PRV Bartha-k61株以Vero细胞培养。

1.5 DNA的提取

按Trizol试剂盒说明书进行。

1.6 PCR扩增

以PRV病毒DNA为模板进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 PCR产物的克隆

应用DNA快速纯化回收试剂盒对PCR产物进行纯化后克隆，测序。

1.8 探针的标记

以纯化回收的PRVgE基因片段为模板进行标记。

1.9 标记探针敏感性的测定

按照DNA探针标记及检测试剂盒说明检测所制备探针的敏感性。

1.10 标记探针特异性的测定

将PRV-S株 DNA、PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、PPV DNA、PCV DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA点样于NC膜上同核酸探针杂交，加底物显色。

2 结果与分析

2.1 PRV-S株gE基因的PCR扩增

以PRV-S株DNA为模板，对其gE基因进行PCR扩增，结果出现一条特异性条带，长度与预期的304bp相符，结果见图1：

图1 猪伪狂犬病毒gE基因的PCR扩增1：gE基因的扩增产物；M：DL2000 DNA Marker

2.2 PCR产物的克隆与测序

将PCR扩增产物克隆后测序。测序结果证明PCR扩增片断与PRV-S株gE基因同源性为100%。

2.3 核酸探针敏感性试验

将上述PCR扩增的DNA片段分别按1∶10、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400进行稀释后进行斑点杂交试验。试验可见当PCR产物稀释6400倍时仍可见到阳性杂交信号，说明本探针至少可检测到4pg的DNA片段。结果见图2。

图2 核酸探针敏感性检测

2.4 核酸探针特异性试验

在同一条NC膜上同时点上PRV-S株DNA、PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、PPV DNA、PCV DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA，进行探针的杂交试验。结果见图3。本探针不与PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、PPV DNA、PCV DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA，而只与PRV-S株DNA有很好的反应性，说明该核酸探针具有良好的特异性。

图3 核酸探针特异性检测

3 讨论

核酸探针技术是近年来迅速发展起来的一种新型分子生物学技术，利用PRV DNA作为探针，曾检出过10 pg，l～5 pg的PRV DNA。

在实施根除伪狂犬病计划的近20年来，疫苗扮演了重要的角色。在各种疫苗中基因缺失疫苗是应用最广泛的，常见的缺失基因有gE、gI、TK等。gEˉ可作为标志基因，区别PRV野毒株和gE基因缺失株。与一定的检测方法结合，便能用免疫接种和捕杀阳性动物相结合的方法来根除PRV。本研究就是通过PCR扩增了一段304 bp的猪伪狂犬病毒gE基因片段，将其作为核酸探针来对PRV野毒株进行检测。经试验证明该探针只与同源DNA出现阳性杂交信号，而与PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、PPV DNA、PCV DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA的杂交结果均为阴性，具有良好的特异性。敏感性检测结果表明，该探针最低可检出4 pg的同源DNA，具有很高的灵敏度。故该探针可用于检测伪狂犬病野毒感染。