印度南瓜果皮和果肉颜色遗传分析及基因定位

葛 宇，李 雪，杨晓霞，徐文龙，崔崇士，屈淑平＊

（1东北农业大学园艺学院，哈尔滨150030；2中国热带农业科学院海口实验站，海口570102）

印度南瓜果皮和果肉颜色遗传分析及基因定位

葛 宇1，2，李 雪1，杨晓霞1，徐文龙1，崔崇士1，屈淑平1＊

（1东北农业大学园艺学院，哈尔滨150030；2中国热带农业科学院海口实验站，海口570102）

以印度南瓜‘98－2－351’与‘06820－1’杂交构建F2群体，对亲本及各世代群体成熟果实果皮和果肉颜色进行调查、统计分析。结果表明：F2群体中果皮桔红色和灰色的分离比呈3∶1，说明果皮灰色是由单隐性基因控制；F2群体中果肉黄色和白色的分离比呈3∶1，说明果肉白色也是由单隐性基因控制。利用群体分离分析法结合隐性群体分析法，采用SSR分子标记，找到了2个与控制灰色果皮基因位点CmRc紧密连锁的SSR标记（PU078072和PU013839），其连锁遗传距离分别为5.9cM和14.5cM；同时找到了1个与控制白色果肉基因位点CmFc紧密连锁的SSR标记PU132712，其连锁遗传距离为6.7cM。本研究为进一步筛选与控制印度南瓜果皮和果肉颜色基因更加紧密连锁的分子标记及相关基因的精确定位奠定了基础。

印度南瓜；果皮颜色；果肉颜色；群体分离分析法；隐性群体分析法

南瓜属包含一些重要的栽培种，其中中国南瓜、美洲南瓜和印度南瓜这3个栽培种在世界范围内均被认为是经济价值较高的作物，有“世界性蔬菜”的美称［1］。南瓜属作物果皮与果肉颜色各异，果皮有墨绿、黄红、橙红、绿色等不同颜色，果肉一般为橘黄色、黄色或白色，均是较为复杂的性状。

对于南瓜果皮颜色遗传规律，在印度南瓜和美洲南瓜上的研究结果表明：幼果黄皮对绿皮表现为不完全显性，且在不同美洲南瓜品种上其显性程度不同，同时发现幼果皮色与耐冷性具有一定的相关性［2－4］。此外，在美洲南瓜中已发现有13个基因位点控制果实发育期间果皮的着色，其中起主效作用的有3个基因位点（D、l－1、l－2）［5］。D基因对果实发育早期果皮的着色并不起作用或作用不明显，从授粉10d后作用才逐渐显现。含有显性D基因位点（D／－）的果实颜色将逐渐发深，而含有隐性d基因位点（d／d）的果实颜色不变。隐性l－1和l－2两基因位点促使幼嫩果实的果皮着色较浅，而含有显性L－1和L－2基因位点（L－1／－，L－2／－）的果实颜色在果实发育期将逐渐发深［6］。向成钢［7］以红皮吊瓜和‘绿Agol’2个印度南瓜品种为亲本构建了一个六世代临时遗传群体，得到皮色是受核基因控制的一个性状，在成熟的果实中，瓜皮色非全绿对全绿表现为显性单基因控制的质量性状。李晓林等［8］以砍瓜和中国南瓜品种‘广西蜜本’以及杂种F1为研究对象，利用POD和Est同工酶进行测定，结果表明F1代花皮瓜为黄色，青皮瓜为橙红色，都接近于‘广西蜜本’的橙红色，属于偏父遗传。

南瓜在果肉颜色性状的遗传规律上研究较少，只对美洲南瓜进行了一些研究。研究人员发现在美洲南瓜果实发育中期，黄色对绿色为显性并把控制黄色果肉的基因命名为Y基因；在美洲南瓜成熟后，白色果肉或浅白色果肉对有颜色果肉为显性，并且分别控制白色果肉和浅白色果肉的W和WF基因之间还存在遗传互补关系［9］。

在基因定位方面，Brown等［10］率先开展了南瓜属作物瓜皮颜色基因的定位分析，他们以美洲南瓜和中国南瓜为亲本，构建了一个分子遗传图谱，定位了一个控制早熟黄色果皮的基因位点B。随后，Gong等［11］构建了一个中国南瓜分子遗传图谱，并在同一条连锁群上（LGm5）发现了2个与绿色果皮相关的基因位点，分别命名为GrNL和GrZHOU。近期，研究人员又构建了2个美洲南瓜分子遗传图谱，按照检测南瓜果皮与果肉颜色方法的精细程度，把这2个性状分别定为数量或质量性状2种类型，对多个果皮与果肉颜色进行初步定位，找到多个QTL基因位点［12］。

本实验研究印度南瓜果肉和果皮颜色性状的遗传规律，然后利用SSR分子标记结合F2分离群体对控制这2个性状的基因进行初步定位。为研究印度南瓜果肉和果皮颜色基因的图位克隆以及果肉和果皮颜色形成机理奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

材料‘06820－1’果肉黄色、果皮桔红色，‘98－2－351’果肉白色、果皮灰色，都是经多代选育的自交系，由东北农业大学园艺学院南瓜育种研究室提供。

1.2 果皮和果肉颜色鉴定及遗传分析

以‘06820－1’（P1）和‘98－2－351’（P2）为亲本，两亲本正反交配制杂交组合，F1自交获得F2群体。2012年春，在哈尔滨香坊繁育基地种植亲本、正反交F1代及F2代。亲本和正反交的F1各20株，F2群体201株，每株保留1个果实，常规田间管理。

2012年秋季南瓜果实成熟时，观测亲本及F1、F2群体的果皮颜色，并参照中国农业科学院蔬菜花卉研究所南瓜种质资源调查记载标准，将南瓜果皮颜色分为2个等级：桔红色和灰色（图1，A），用卡平方检验计算分离比。南瓜果实成熟时，用标准比色卡测亲本及F1、F2群体的果肉颜色，将其果肉颜色分为5个等级（图1，B）。将0、1级定为白色，2、3、4级定为黄色，用卡平方检验计算分离比。

1.3 果皮和果肉颜色基因初步定位

1.3.1 基因池的构建 亲本、F1与F2群体植株叶片采回后保存于－20℃冰箱中，采用SDS法提取各植株DNA［13］。在F2代群体中分别选出极显著的果皮桔红色和灰色、果肉黄色和白色各10个单株，将其DNA样品分别等量混合，组成果皮桔红色与灰色和果肉黄色与白色两组基因池。

1.3.2 标记与果皮和果肉颜色基因的连锁分析共用1 389对SSR引物，其中300对引物序列来自于Gong等［14］公开发表的引物序列；1 089对来自www.icugi.org数据库，根据数据库中的序列经比对，挑选、合成引物用于该实验。所有引物均由上海生物工程技术公司合成。PCR反应体系及程序参照文献［15］。采用群体分离分析法，通过SSR分子标记筛选亲本之间的多态性，利用亲本间具有多态性的标记分别对果皮桔红色与灰色和果肉黄色与白色两组基因池进行检测，寻找连锁标记。利用F2代群体中果皮和果肉颜色表型为隐性的单株，使用隐性群体分析法，分析SSR标记与基因位点的连锁情况。

1.3.3 构建局部基因连锁图 利用JoinMap 3.0［16－17］软件，分析SSR标记与控制果皮和果肉颜色基因位点的连锁关系和遗传距离，用MapChart 2.1［18］软件绘制局部连锁图。

2 结果与分析

结果表明：P1亲本‘06820－1’及正反交F1所有单株的果皮均为桔红色，P2亲本‘98－2－351’所有单株果皮均为灰色，说明果皮桔红色对灰色为显性，且由核基因控制。在201个F2群体单株中有个别单株在果皮颜色上出现桔红色果皮伴有灰色斑块现象。由于南瓜果皮颜色较为复杂，本实验排除南瓜果皮条纹、斑块等性状，只针对果皮颜色进行简单的探讨，将出现上述现象的单株剔除后对剩下的185株进行果皮颜色遗传规律分析及基因定位研究。剩余F2群体中129株果皮为桔红色，56株果皮为灰色。经卡平方验证，果皮桔红色和灰色分离比例符合3∶1比例（χ2＝1.29，P＜0.05），表明印度南瓜果皮灰色性状是由单隐性基因控制，并将此基因暂时命名为CmRc（Cucurbita maxima rind color）。

通过对亲本、F1及F2群体进行调查统计分析，结果表明：亲本‘06820－1’及正反交F1所有单株的果肉均为黄色，亲本‘98－2－351’所有单株果肉均为白色，说明果皮黄色对白色为显性，且由核基因控制。在201个F2群体单株中148株果肉为黄色，53株果肉为白色。经卡平方验证，果肉黄色和白色分离比例符合3∶1比例（χ2＝0.15，P＜0.05），表明印度南瓜果肉白色性状是由单隐性基因控制，并将此基因暂时命名为CmFc（Cucurbita maximaflesh color）。

2.2 多态性标记的筛选

利用1 389对SSR引物在亲本间进行筛选，其中只有94对SSR引物在亲本之间的扩增条带存在多态性，多态率为6.77%。利用这94对SSR引物

2.1 果皮与果肉颜色遗传分析

通过对亲本、F1及F2群体进行调查统计分析，对果皮桔红色基因池和果皮灰色基因池进行PCR扩增，只有2个SSR引物PU013839和PU078072在两池间具有明显的多态性。同样，利用这94对SSR引物在果肉黄色和白色基因池进行PCR扩增，仅有1个SSR引物PU132712在两池间具有明显的多态性。引物PU013839、PU078072和PU132712在亲本、F1、基因池及所构建基因池的各单株上的扩增结果如图2～3所示。

2.3 CmRc和CmFc基因的初步定位

根据果皮颜色基因池筛选的结果，用SSR标记PU013839和PU078072在185个F2群体单株之间进行PCR扩增，检测F2群体单株果皮颜色的基因型。SSR标记PU013839和PU078072扩增结果经卡方测验数值分别为2.5和符合3∶1分离比例（表1）。SSR标记PU013839在部分F2群体单株上的基因型如图4所示。

利用Joinmap 3.0软件分析PU078072和PU013839这2个标记及CmRc基因位点的分离情况，结果表明这2个标记分别位于CmRc基因位点两侧，其遗传距离分别为5.9cM和14.5cM（图6）。

利用SSR标记PU132712检测201个F2群体单株，有53个单株扩增出与亲本‘06820－1’相同的条带，40个单株扩增出与亲本‘98－2－351’相同的条带，还有108个单株扩增出杂合条带（图5）。经卡方测验数值，符合3∶1分离比例。

利用Joinmap 3.0软件分析PU132712标记和CmFc基因位点的分离情况，结果表明这个标记与CmFc基因位点遗传距离为6.7cM（图7）。

3 讨 论

南瓜果皮和果肉颜色是南瓜的重要标志性状之一。据目前已有的相关报道，南瓜桔红色和灰色果皮颜色与黄色和白色果肉颜色性状均是由果皮与果肉中的类胡萝卜素含量所决定的，颜色深浅度与类胡萝卜素含量呈正相关关系［19－20］。

Brown等［10］按照果皮颜色为质量性状进行评价，通过对中国南瓜和美洲南瓜杂交群体进行观察，发现早熟黄色果皮对早熟绿色果皮为不完全显性。同时利用RAPD分子标记对早熟黄色果皮基因位点B进行定位，其紧密连锁标记与该基因位点的遗传距离为27.1cM。Gong等［11］同样按照果皮颜色为质量性状进行评价，通过对美洲南瓜杂交群体进行观察，发现绿色果皮对浅黄色果皮为显性，其紧密连锁的SSR标记与绿色果皮基因位点GrNL和GrZHOU的遗传距离分别为12.7和9.4cM。本研究F2群体中，同样按照印度南瓜果皮和果肉为质量性状进行评价，结果表明印度南瓜灰色果皮和白色果肉基因表现为单基因隐性遗传，其最紧密连锁的SSR标记与灰色果皮和白色果肉基因位点CmRc和CmFc的遗传距离分别为5.9和6.7cM。本实验与前人实验一样，所得到的连锁标记与目的基因位点的遗传距离仍较大，在实际分子标记辅助选择上应用受限。今后还需要进一步开发引物，筛选与相关基因位点更加紧密连锁的分子标记，为印度南瓜灰色果皮和白色果肉基因位点的精确定位奠定基础。

参考文献：

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（编辑：宋亚珍）

Genetic Analysis and Gene Mapping of Rind and Flesh Color of Cucurbita maxima

GE Yu1，2，LI Xue1，YANG Xiaoxia1，XU Wenlong1，CUI Chongshi1，QU Shuping1＊
（1Department of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin，150030，China；2Haikou Experimental Station，Chi
nese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou，570102，China）

The F2population was derived by crossing two diverse Cucurbita maxima lines‘98－2－351’and‘06820－1’.Investigation and statistical analyses were conducted on rind and flesh color of mature fruits for parental plants and each generation.The results demonstrated that the orange and grey rind plants in F2population were fitted for the ratio of 3∶1，indicating that the grey rind was controlled by a single recessive gene；similarly，the yellow and white flesh plants in F2population were also fitted for the ratio of 3∶1，showing that the white flesh was controlled by a single recessive gene.With bulked segregation analysis and recessive－class approaches，two SSR markers PU078072and PU013839were detected to be tightly linked to the locus CmRc at a distance 5.9and 14.5cM，respectively.Meanwhile，one SSR marker PU132712was founded to be closely linked to the locus CmFc at a distance 6.7cM.This study laid the foundation for further screening the molecular markers closer linked to rind and flesh color genes of C.maximaand locating them accurately.

Cucurbita maxima；rind color；flesh color；bulked segregation analysis；recessive－class approaches

Q343.1＋7；S642.1

A

1000－4025（2015）08－1524－06

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1524

2015－03－11；修改稿收到日期：2015－05－22

公益性行业（农业）科研专项（201303112）

葛 宇（1982－），男，博士，助理研究员，主要从事园艺植物生物技术研究。E－mail：geyu198224＠gmail.com

＊通信作者：屈淑平，博士，教授，硕士生导师，主要从事南瓜育种。E－mail：qushuping＠sohu.com