日本晚樱PrseSHP基因的克隆与功能分析

刘志雄，李来运，李凤兰

（1长江大学园艺园林学院，湖北荆州434025；2北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083）

日本晚樱PrseSHP基因的克隆与功能分析

刘志雄1，2，李来运1，李凤兰2

（1长江大学园艺园林学院，湖北荆州434025；2北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083）

采用同源克隆方法结合RACE技术，从日本晚樱（Prunus lannesiana）品种‘大岛樱’中克隆到花发育调控相关的PrseSHP基因（GenBank登录号为GU362645）。PrseSHP基因序列全长1 223bp，包含1个长741bp的完整开放阅读框，编码246个氨基酸和1个终止密码子。分子系统发生分析表明，PrseSHP属MADS－box转录因子的PLE／SHP进化系，并与蔷薇科植物的SHP同源蛋白聚于同一进化分支；蛋白序列比对显示，该转录因子拥有M、I、K和C共4个结构域，且其C末端结构域中包含高度保守的AGⅠ和Ⅱ基序。基因表达分析表明，PrseSHP基因主要在‘大岛樱’的花瓣、雄蕊、雌蕊和幼果等器官中表达，在花萼中仅能检测到微弱的转录信号，在幼叶中不表达，与其他植物SHP同源基因的表达模式有一定的差别。功能分析显示，转PrseSHP基因拟南芥植株明显比野生型拟南芥弱小，转基因拟南芥在6～8片莲座叶后即抽薹开花，时间较野生型拟南芥（14～17片莲座叶后抽薹开花）明显提前，证明异位表达的PrseSHP基因能促进拟南芥早花，其在花发育过程中可能参与调控植物开花。

日本晚樱；花发育；MADS－box；PrseSHP

日本晚樱（Prunus lannesiana）是蔷薇科（Rosaceae）著名的观赏花木。其花色艳丽，冠型优美，品种多，适应性广，观赏价值高，被广泛用于城市园林景观建设［1］。随着近年国内赏樱热持续升温，选育或引进名优樱花品种，增加城市园林多样性，满足人们对人居环境日益增长的审美需求显得尤为重要。中国樱花种质资源丰富，开展樱花生殖发育调控研究，对樱花杂交育种、遗传改良和种质创新等均有较重要的意义。在拟南芥中，SHATTERPPOOF（SHP）是参与调控雌蕊、子房、胚珠和果实发育的C类MADS－box基因，并具有促进角果正常开裂的功能［2］。近年研究发现，SHP基因还参与调控植物的胎座发育［3］。FBP6是矮牵牛（Petunia hybrida）SHP同源基因，其除参与调控心皮发育和果实开裂外，还具有调控雄蕊正常发育和决定花分生组织特征的功能［4］；本氏烟草（Nicotiana benthamiana）的SHP同源基因NbSHP与FBP6基因功能相似［5－6］。但在茄科植物番茄（Solanum lycopersicum）中，其SHP同源基因TAGL1仅参与调控果皮的发育与果实的成熟，并不参与花分生组织特性决定，也未在雌蕊中表达［6－7］。而豆科苜蓿属（Medicago）植物中的SHP同源基因有参与种间荚果形态分化的功能［8］。蔷薇科植物桃（Prunus persica）的SHP同源基因PperSHP在成熟果实中的表达量明显升高，并且在中、内果皮明显分离的栽培品种中表达更强［9，10］；FaSHP为草莓（Fragaria× ananassa）的SHP同源基因，其表达量的减少能延缓果实的成熟［11］。上述研究表明，不同类群被子植物中的SHP同源基因，参与植物生殖发育调控的同时，其功能伴随被子植物的演化而发生了分化。

相对模式植物和草本园艺作物而言，园林树木童期长，生殖发育过程复杂并季节性开花，相关研究相对滞后。本研究以日本晚樱里樱系野生单瓣品种‘大岛樱’（P.lannesiana‘Makino’）为试材，系统研究其SHP同源基因在花和果实发育过程中的表达模式和功能，为樱花的分子辅助育种积累资料。

1 材料和方法

1.1 材 料

2009年4～5月采集‘大岛樱’的幼叶、花芽和幼果，将雌雄蕊刚发育成熟但未开放的花蕾按花萼、花瓣、雄蕊与雌蕊分开，并将这4轮花器官、幼叶和幼果立即用液氮速冻，后－80℃保存备用。

1.2 方 法

1.2.1 日本晚樱PrseSHP基因克隆 用EASYspin植物RNA提取试剂盒（北京艾德莱）提取‘大岛樱’花芽总RNA，按试剂盒说明书操作。参照文献［1］的方法合成第一链cDNA和3′－RACE扩增，3′－RACE基因特异引物为GSPSHP；根据获得的3′－RACE扩增序列设计5′－RACE扩增引物，利用5′－RACE试剂盒（Version 2.0，invitrogen公司），参照文献［12］的方法，扩增日本晚樱PrseSHP基因的5′端序列，5′－RACE的第一链cDNA合成引物为GSP1SHP，第1次PCR和巢式PCR反应的基因特异引物分别为GSP2SHP和GSP3SHP。根据5′－RACE和3′－RACE扩增序列进行电子拼接，在基因的5′－UTR和3′－UTR区设计克隆日本晚樱PrseSHP基因全长引物，验证拼接序列的真实性并分离出PrseSHP基因。PCR扩增的上下游引物为PrseSHPF和PrseSHPR。PCR扩增退火温度为56～58℃、阳性克隆鉴定参照文献［12］。所用引物（表1）均由生工生物（上海）股份有限公司合成，DNA由华大基因测序。

1.2.2 蛋白同源比对与分子系统发生分析 将PrseSHP基因编码的蛋白在NCBI数据库中执行Blast搜索与同源比对。并将PrseSHP转录因子同NCBI上SHP同源蛋白序列进行比较。用MEGA5.0软件，选邻接法（Neighbour joining，NJ）构建分子系统发生树［13］。

1.2.3 半定量RT－PCR检测PrseSHP基因表达的组织特异性 提取‘大岛樱’幼叶、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊和幼果中的总RNA，检测其质量与完整性，将其逆转录成第一链cDNA。用半定量RT－PCR技术检测PrseSHP基因在这6种器官中表达的组织特异。并根据PrseSHP基因的特异序列设计上下游引物RTSHPF和RTSHPR，进行RT－PCR分析之前，检测引物的特异性；以日本晚樱Actin基因作内参，内参引物序列和RT－PCR检测参考文献［14］。

1.2.4 载体构建与功能分析 将PrseSHP基因包含完整开放阅读框（ORF）的正义片段插入到XbaⅠ和SmaⅠ限制性酶切位点之间，并将其克隆到表达载体pBI121上，构建载体的上下游引物为TPrseSHPF和TPrseSHPR。将构建好的pBI121－PrseSHP表达载体导入农杆菌GV3101－90菌株，在农杆菌的介导下，用浸花法将35S：：PrseSHP转入野生型拟南芥Col－0［15］。收获拟南芥T1代种子，消毒除菌后置于含50μg／mL卡拉霉素的1／2MS培养基上4℃暗培养24h，后转入22℃，光暗周期16h／8h的温室中培养10d，筛选根系发育良好，且真叶和生长点都为绿色的植物为阳性转化苗，经炼苗、壮苗后移置到人工气候箱，待开花后进行实时荧光定量PCR（quantitative real time RT－PCR，qRT－PCR）鉴定，检测PrseSHP在转基因拟南芥中的表达水平。作qRT－PCR分析时，以拟南芥Actin基因为内参，非转基因拟南芥为阴性对照，qRTPCR分析用的内参基因上下游引物为qactinF和qactinR，PrseSHP基因的上下游引物为qPrseSHPF和qPrseSHPR，并观察外源基因表达量高的转基因拟南芥表型，分析PrseSHP基因的功能。

2 结果与分析

2.1 PrseSHP基因全长cDNA序列的克隆

同源克隆方法结合RACE技术，从‘大岛樱’花芽中分离出PrseSHP基因完整cDNA全长。序列结构分析表明，日本晚樱PrseSHP基因序列cDNA全长为1 223bp，包括264bp的5′－UTR、741bp的完整ORF和218bp的3′－UTR，编码246个氨基酸和1个终止密码子。在NCBI网站上执行Blast搜索和序列同源比对显示，其与MADS－box基因家族中的SHP进化系亲缘关系最近，命名为PrseSHP，GenBank登录号为GU362645。

2.2 蛋白序列同源比对与分子系统发生分析

图1表明：日本晚樱PrseSHP与桃的PperSHP亲缘关系最近，同苹果的MdMADS14亲缘关系次之，三者同其他蔷薇科植物的SHP同源蛋白聚于同一进化分支，与其他科属植物的SHP同源蛋白分开，聚类结果支持传统经典分类学种属间的亲缘关系。蛋白序列同源比对（图3）显示：PrseSHP转录因子包含1个高度保守的MADS结构域，由57个氨基酸残基组成（16～72）；1个次级保守的K结构域，含82个氨基酸（105～186），由K1（105～126）、K2（139～153）和K3（161～186）3个含疏水氨基酸残基的亚结构域［16］；其MADS区与K区之间，含1个保守性相对较低的间隔区I区，由32个氨基酸残基组成（73～104）；该转录因子C末端结构域序列变异较大，由60个氨基酸残基组成（187～246），包含2个十分保守的AGⅠ和Ⅱ基序，属C类转录因子；另外，该转录因子的N末端还有一段由15个氨基酸残基组成的延伸序列。

2.3 花器官与幼果中PrseSHP基因表达的半定量RT－PCR检测

半定量RT－PCR检测（图2）显示：PrseSHP主要在‘大岛樱’的花和果中表达，在幼叶中不表达；其在花瓣、雄蕊和雌蕊中表达量高，在花萼中表达量低。且PrseSHP基因在‘大岛樱’花瓣、雄蕊，雌蕊和幼果中的表达差异不显著（P＞0.05），但其在这些器官中的转录活性均显著高于花萼（P＜0.05）。

2.4 PrseSHP基因的功能分析

为进一步验证PrseSHP基因在日本晚樱生殖发育过程中的功能，将PrseSHP基因的正义片段克隆到双元表达载体pBI121中，经农杆菌介导转入野生拟南芥。抗生素筛选和qRT－PCR鉴定（图4）结果共获得23棵35S：：PrseSHP拟南芥转基因植株，跟踪观察这些转基因拟南芥植株的表型发现，23株转基因拟南芥中有17株拟南芥开花时间明显提前，占转基因植株总数的73.9%，其在6～8片莲座叶后即抽薹开花（图5，B、C），而相同生长条件种植的野生型拟南芥要长到14～17片莲座叶后才抽薹开花（图5，A）。并且，所有转基因植株明显比野生型拟南芥弱小，但其花器官结构未见明显改变（图5，B、C）。说明PrseSHP基因在花发育过程中能促进植物早花。

3 讨 论

同源序列比对与分子系统发生分析表明，‘大岛樱’PrseSHP属C类MADS－box转录因子的PLE／SHP进化系，并与蔷薇科植物SHP同源蛋白聚于同一进化分支。表达分析表明，PrseSHP主要在‘大岛樱’的花瓣、雄蕊、雌蕊和幼果等器官中表达，在花萼中仅能检测到微弱的转录信号，在幼叶中不表达，其表达模式与其他类群植物中的SHP同源基因有一定的差异。

PperSHP为日本晚樱近缘种桃的SHP同源基因，其仅在雄蕊、雌蕊和果实中表达，主要参与果实的发育［9］；而蔷薇科另一植物太行花的SHP同源基因TrSHP仅在发育中的雄蕊和雌蕊中表达，随着子房中胚珠的发育，其转录活性仅局限在胚珠中，参与调控胚珠的发育［17］。TAGL1为茄科植物番茄的SHP同源基因，在花发育过程中其主要在雄蕊和雌蕊中表达，并且在花瓣中也能检测到微弱的转录信号；但在果实发育过程中，其仅在果皮中表达，参与调控果皮的发育与果实的成熟［7］；FBP6是矮牵牛的SHP同源基因，其主要在雄蕊、柱头和胚珠中表达，除参与调控雌蕊发育和果实开裂外，还参与调控花分生组织的形成，促进植物开花［4］。可见，不同类群植物中SHP同源基因除表达模式变化外，其功能也发生了相应的分化。从日本晚樱PrseSHP基因的表达模式及35S：：PrseSHP转基因拟南芥的表型推测，PrseSHP在发育过程中具有促进开花和参与调控果实发育的功能，其具体的调控机制仍有待进一步研究。

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（编辑：宋亚珍）

Cloning and Function Identification of PrseSHPGene from Prunus lannesiana（Rosaceae）

LIU Zhixiong1，2，LI Laiyun1，LI Fenglan2
（1College of Horticulture and Gardening，Yangtze University，Jingzhou，Hubei 434025，China；2College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

Full cDNA of one MADS－box gene，PrseSHPwith GenBank accession No.GU362645，was cloned from Prunus lannesiana using homologous cloning and RACE method.The full length of PrseSHPcDNA is 1 223bp，containing an open reading frame（ORF）of 741bp and coding for a polypeptide of 246amino acid residues.Sequence and phylogenetic analyses grouped PrseSHP into PLE／SHP lineages of the MADS－box family.Conceptual translation revealed that PrseSHP contain MADS，I，K and C domains.Expression analysis suggested that PrseSHPexpressed mainly in petal，stamen，gynoecium and young fruit of P.lannesiana‘Makino’.Moreover，functional analysis suggested that transgenic Arabidopsis was obviously dwarf，and flowering during 6－8rosette leaves，which was early than that of wild－type Arabidopsis who was flowering during 14－17rosette leaves.Ectopic expression of PrseSHPcould obviously promote flowering of transgenic Arabidopsis.Our results suggest that PrseSHPare involved in flowering in Cherry Blossom.

Prunus lannesiana；flower development；MADS－box；PrseSHP

Q786

A

1000－4025（2015）08－1506－05

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1506

2015－05－15；修改稿收到日期：2015－07－17

国家自然科学基金项目（31101202）；长江大学博士启动基金（801190010118）。

刘志雄（1977－），男，博士，副教授，主要从事园林植物分子育种研究。E－mail：zxliu77＠yahoo.com