蛋白激酶D1在大鼠骨髓源性内皮祖细胞中的促血管新生作用

刘 暖，杨 雷，毛秉豫，徐国昌，叶松山，张培华，张?芳

（南阳理工学院医学实验中心，河南南阳 473004）

蛋白激酶D1在大鼠骨髓源性内皮祖细胞中的促血管新生作用

刘 暖，杨 雷，毛秉豫，徐国昌，叶松山，张培华，张?芳

（南阳理工学院医学实验中心，河南南阳 473004）

中国图书分类号：R-332；R329．24；R345．44；R345.57；R364.3；R977.3

摘要：目的 探讨蛋白激酶D1（PKD1）对大鼠骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）黏附、迁移、增殖、血管形成能力及内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）表达的影响。方法 体外培养、分离和鉴定大鼠骨髓源性EPCs，观察PKD1及其特异性阻断剂CID755673对EPCs的黏附、迁移、增殖、血管形成能力的影响，以及对EPCs中eNOS的mRNA表达和蛋白表达的影响。结果 EPCs体外细胞培养实验表明，PKD1可明显促进EPCs的黏附、迁移和增殖，提升EPCs的血管形成能力，上调EPCs中eNOS的mRNA表达和蛋白表达水平。结论 PKD1具有调控EPCs促血管新生的作用，其促血管新生的作用可能以一种依赖eNOS的方式进行。

关键词：蛋白激酶D1；内皮祖细胞；血管新生；内皮型一氧化氮合成酶；迁移；增殖

网络出版时间：2015－8－10 14：37 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．016．html

蛋白激酶D（protein kinase D，PKD）属于进化上高度保守的钙／钙调蛋白依赖性的丝氨酸／苏氨酸激酶家族，其重要家族成员之一PKD1参与很多基础的生物进程调节，包括信号转导、细胞的增殖和分化、跨膜转运、分泌、免疫调节、心肌细胞的收缩、血管新生、肿瘤等［1］。特别是PKD1在肿瘤形成的进程中倍受关注，PKD1信号级联反应和胰腺癌、肝癌、胃癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌等的发生发展密切相关［2］，其原因在于PKD1既可以直接促进癌细胞的增殖和分化，又促进癌细胞生长区域血管的新生。鉴于此，抗PKD1抑制肿瘤的方法在胰腺癌、乳腺癌等治疗中已经被提出，如特异的PKD1抑制剂CRT0066101可以明显抑制小鼠胰腺癌肿瘤细胞的增生［2］。

近年来，在缺血性心血管系统疾病的治疗中，内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）疗法是潜在的最有希望的治疗策略之一，其可以被诱导分化为心肌细胞和血管平滑肌细胞［3］，实现缺血损伤心肌组织真正意义上的血管新生。PKD1既然可以促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤组织中血管的新生，那么是否也可能有促进EPCs黏附、迁移、增殖，诱导EPCs分化为血管的作用？本研究拟对此进行探讨并分析其可能作用机制，为以“PKD1”这一潜在可能靶点治疗缺血性心血管疾病提供新的思路。

1　材料与仪器

1．1实验动物 SD大鼠购自河南省实验动物中心，♂，清洁级，8周龄，重约200～240 g，动物生产许可证号：SCXK（豫）2010－0002，动物质量合格证号：1000142。

1．2药物与试剂 PKD1购自美国Pierce公司（生产批号为OSP00005W），PKD1特异阻断剂CID755673购自美国MedChemExpress公司（生产批号为2011756），DNA酶I、Dulbecco′s PBS、FBS、胶原酶I、BrdU、BrdU鼠单克隆抗体购自上海宝曼生物科技有限公司（生产批号分别为LS002004、28374、SH30077、LS004194、83224、MMS-139S-250）；EBM-2培养基购自北京达科为生物技术有限公司（生产批号为CC-3156）；CD133、CD34、eNOS、VEGFR-2抗体购自天津恒业生物科技有限公司（生产批号为EL910835、EL162014、EL163112和EL171852）；羊抗兔IgG、DAB显色液购自武汉博士德生物工程有限公司（生产批号为TC1378、DD1660）；FN、FITC和DAPI购自北京碧橙蓝生物科技有限责任公司（生产批号为PA127507、PA185438和62247）；其它试剂为国产分析纯。

1．3主要仪器 A2-1389型生物安全柜（美国Thermo Scientific公司）；164-5052型PowerPac HC

电泳仪及FACSCanto II型流式细胞仪（美国BIO-RAD公司）；Bullet Blender Storm组织细胞破碎仪（美国Next Advance公司）；Nikon Tis型荧光显微镜及Nikon NIS-Elements Software BR分析系统（日本尼康公司）。

2　方法

2．1EPCs的体外分离、培养和鉴定 取体重为200～240 g的健康♂SD大鼠，颈椎脱臼处死后，75%乙醇浸泡10 min，无菌操作环境下取出胫腓骨，用含肝素及DNA酶I的Dulbecco′s PBS反复冲洗骨髓，收集骨髓液，小心置入等量的淋巴细胞分离液之中，1 700 r·min－1离心30 min，无菌毛细吸管吸取分离液中间白膜层，5×PBS重悬细胞，离心后再用含2%FBS的EBM-2培养基重悬，按每平方厘米105个标准接种于培养板中，24 h后将未贴壁的细胞悬液转入预先用50 mg·L－1FN包被的6孔细胞培养板中培养，3 d后换第1次液，之后每隔3 d换液1次，倒置显微镜下进行细胞形态学观察，7－10 d后，待细胞融合80%后，采用胶原酶Ⅰ消化后传代培养。对培养的内皮细胞观察其生长状态，分别在4、7、10、14 d照相并记录。对新分离的骨髓单核细胞进行滴片，于d 4、7、10、14取生长良好的原代细胞，重悬于PBS中，分别与EPCs细胞表面标记物CD133、CD34、VEGFR-2结合，再用FITC染色，DAPI复染，检测上述标记物阳性表达的细胞。

2．2PKD1对EPCs黏附的影响 提前用50 mg· L－1FN包被细胞培养板，每孔再接种5×104个EPCs，培养过夜，形成单皮层后转入无血清培养基培养5 h，用钙黄绿素标记EPCs后的制备单细胞悬液，37℃下孵育30 min。实验分5个组：A组，空白对照组；B组，25 μg·L－1PKD1干预组；C组，50 μg ·L－1PKD1干预组；D组，100 μg·L－1PKD1干预组；E组，PKD1（100 μg·L－1）＋CID755673（100 μg·L－1）干预组，以下简称CID755673干预组。每组设置6个复孔，实验重复3次。各组干预后，在37℃下、5%CO2孵箱中孵育30 min，用PBS轻轻冲洗细胞，去除未黏附细胞，倒置显微镜40×下，随机取6个视野拍照，计数黏附细胞个数，取平均值。

2．3PKD1对EPCs迁移的影响 用8 μm孔径的24孔transwell进行迁移实验，先分别在细胞小室的上、下室加入50 mg·L－1FN，再注入含2%FBS的EBM-2培养基。然后在上室按照每孔2×104个的密度接种EPCs，在下层加入A组：空白对照EBM-2；B-D组：PKD1（25、50、100 μg·L－1）；E组：PKD1 （100 μg·L－1）＋CID755673（100 μg·L－1），每组设置6个复孔，实验重复3次。培养24 h后，用棉签擦去上室内的细胞，2%多聚甲醛固定，Giemsa染色，40×下随机取6个视野，倒置显微镜下计数迁移过膜的细胞数量，取平均值。

2．4PKD1对EPCs增殖的影响 将EPCs用含2%FBS的EBM-2的基础培养基重悬，每孔104个加入96孔培养板中，待细胞贴壁后，更换无血清培养基培养，每孔加入终浓度为10 μmol·L－1的BrdU孵育。实验分组同“2.2”。分别在培养的24、48和72 h后，每孔加入100 μL的BrdU鼠单克隆抗体（1∶100）室温孵育1 h后，wash buffer冲洗2次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀释）孵育1 h后，wash buffer再次冲洗2次，加入100 μL TMB过氧化物酶底物室温避光孵育30 min，加入100μL终止液，酶联免疫检测仪450 nm波长处读取各孔吸光度值（A450），取其平均值。

2．5PKD1对EPCs血管形成能力的影响 将EPCs用含2%FBS的EBM-2的基础培养基重悬，每孔5×104个加入Matrigel-Matrix预处理的48孔培养板中，待细胞贴壁后，更换无血清培养基培养。实验分组同“2.2”。在培养的72 h后，40×倒置显微镜下观察管状结构数量，随机选择6个视野照相，取其平均值。

2．6PKD1对EPCs中eNOS mRNA转录表达的影响 将EPCs用含2%FBS的EBM-2的基础培养基重悬，每孔105个加入6孔培养板中，待细胞贴壁后，更换无血清培养基培养。实验分组同“2．2”。在培养24 h后，TRIzol法提取EPCs总RNA，根据GenBank序列，分别设计eNOS的上下游引物为5′-CTGCTGCCCCAGATATCTTC-3′和5′-CAGGTACTG-CAGTCCCTCCT-3′，产物长度为230bp。每组细胞取2μg总RNA，根据试剂盒的说明书逆转录合成cD-NA，再取2 μg逆转录产物进行普通PCR，94℃，1 min，95℃，30 s，54℃，1 min，72℃，1 min，30个循环，延伸2 min。取反应产物10 μg进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后AlphaView SA软件摄图，并分析eNOS与β-actin基因的灰度比值。

2．7PKD1对EPCs中eNOS蛋白表达的影响细胞培养实验设计同“2.6”。应用Next Advance Bullet Blender Storm组织细胞破碎仪将EPCs打碎，匀浆，4℃下12 000×g离心2min，提取组织总蛋白后Bradford法测定蛋白浓度，取其中20 μg蛋白进行12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上，5%的脱脂奶粉封闭2 h后洗膜，标记1∶250稀释的eNOS一抗，4℃过夜，洗膜，与辣根过

氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀释）孵育1 h后TBST洗膜，冲洗后暗室曝光显影。同时以β-actin蛋白表达水平作为内参对照。胶片经成像分析系统扫描，并应用AlphaView SA软件分析各样本与β-actin蛋白灰度的比值，记录蛋白相对含量。

2．8统计学处理 采用SPSS 16．0统计软件系统，计量资料以±s表示，多组间均数比较比较用单因素方差分析，组间多重比较用SNK-q检验。

3　结果

3．1EPCs的鉴定 EPCs结合FITC后呈现绿色，DAPI复染后胞核呈蓝色。EPCs呈卵圆形、纺锤形或者不规则状，CD133、CD34或VEGFR-2表达阳性，见Fig 1。

Fig 1 Immunofluorescence detection of CD34（A／D），VEGFR-2 （B／E）and CD133（C／F）for EPCs（×200）

3．2PKD1对EPCs黏附、迁移能力的影响 和对照组相比，PKD1各干预组促EPCs黏附、迁移的能力明显增强（P＜0.05），且呈剂量依赖性（F黏附＝21.323，F迁移＝18.586，均P＜0.05）。加入CID755673干预之后，EPCs的黏附、迁移的能力明显下降（P＜0.05）。见Fig 2。

3．3PKD1对EPCs增殖能力的影响 和对照组相比，24、48、72 h PKD1各剂量组促EPCs的增殖能力均明显升高（P＜0.05），且随剂量增加促增殖能力呈上升趋势；加入CID755673干预之后，EPCs的增殖能力明显下降（P＜0.05）。24、48、72 h时间组组间相比，随时间推移，PKD1各剂量组促EPCs增殖能力均明显升高（F时间＝7.137，P＜0.05）；且时间和剂量均明显影响EPCs增殖（F交互＝10.098，P＜0.05）。见Fig 3。

Fig 2 Effect of PKD1 on migration and adherence in EPCs

Fig 3 Effect of PKD1 on proliferation in EPCs

3．4PKD1对EPCs血管形成能力的影响 与对照组相比，PKD1各干预组EPCs管腔样结构的数目明显增加（P＜0.05），且呈剂量依赖性增加趋势。加入CID755673干预之后，EPCs管腔样结构的数目明显减少（P＜0.05），且管状结构结点模糊。见Fig 4。

Fig 4 Effect of PKD1 on numbers of tube-like structures in EPCs

3．5PKD1对EPCs中eNOS mRNA及蛋白表达的影响 和对照组相比，PKD1各干预组EPCs中eNOS mRNA和蛋白表达水平均明显升高（P＜0.05），和25 μg·L－1PKD1干预组相比，50及100 μg·L－1PKD1干预组EPCs中eNOS mRNA和蛋白表达水平均明显升高（P＜0.05），但后两组组间比较无差异；加入CID755673干预之后，EPCs中eNOS mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05）。见Fig 5－6。

4　讨论

Fig 5 Effect of PKD1 on mRNA expression of eNOS in EPCs

Fig 6 Effect of PKD1 on protein expression of eNOS in EPCs

本研究结果从PKD1激活和阻断两方面均证实PKD1明显促进EPCs的黏附和迁移，且呈剂量依赖性。这可能与PKD1对细胞间黏附分子l（intercellu-lar adhesion molecule 1，ICAM-1）和血管细胞黏附分子l（vascular cell adhesion molecule l，VCAM-1）的活化作用密切相关。ICAM-1和VCAM-1介导EPCs之间的黏附、趋化因子诱导的EPCs跨内皮的迁移，而黏附和迁移是归巢过程中的重要环节［3］。本研究结果同时证实，在24、48、72 h不同时间段，PKD1各剂量干预组均明显增加EPCs的增殖，且呈时间依赖性，时间和剂量方差交互分析证实两者均明显影响EPCs的增殖。这表明，PKD1可以明显促进EPCs的增殖。进一步的研究结果表明，PKD1呈剂量依赖性提升EPCs的管腔样结构数量。之前的研究证实EPCs向缺血组织归巢，分化为成熟的内皮细胞，并通过旁分泌的方式调控现存的内皮细胞，以一种和胚胎时期血管形成相似的方式分化成为血管内皮细胞，进而形成血管［4］。同时，PKD1还可以诱导生成多种生长因子，联合发挥作用，参与血管新生和组织再生的整个修复进程［5］。这和我们的研究结果高度吻合。这表明，PKD1可以通过调控EPCs的黏附、迁移、增殖以及血管形成能力，促进受损组织区域内微血管的新生，而在缺血性心肌组织损伤

修复的进程中发挥着重要的作用。

本研究还分别从PKD1激活和阻断两个截然相反的角度证实PKD1可以明显上调EPCs中eNOS 的mRNA和蛋白表达水平。eNOS和其产物NO在血管系统的稳态维持中扮演着重要的角色，不仅调控着血压水平、血管的紧张度，而且发挥着重要的抗炎、抗氧化、抗血栓形成效应［6］。eNOS的激活是通过1179的丝氨酸激活位点，Akt、CaMKII、AMPK、PKD1均可以通过这一位点而激活eNOS［7－8］。之前的文献报道，在VEGF介导的eNOS激活的进程中，PKD1是必不可少的［9］。也有学者认为，eNOS属于新发现的PKD的底物，因为eNOS被各种氨基酸识别结合激活的位点恰恰均存在于现有报道的PKD底物之内，采用PKD1阻断剂或者基因沉默PKD1均可以以一种依赖eNOS的方式阻断动脉内皮细胞的迁移，减缓受损伤口的愈合［10］。和上述结果相似，我们的研究也表明，PKD1可能以一种依赖eNOS的方式促进EPCs的黏附、迁移、增殖和血管形成。

当前在缺血性心脏病的临床治疗进程中，由于心肌细胞分化和增殖能力极差，心肌组织缺血受损后通常以纤维组织进行疤痕修补，这对修复后的心脏功能产生较大的损害作用［11］。本研究结果对于后续的骨髓源性EPCs移植至心肌梗死大鼠动物模型或者心肌梗死患者受损的心肌组织中，促缺血区域局部血管的新生，以及干预PKD1诱导EPCs分化为内皮细胞，促内皮细胞迁移，减轻或者逆转损伤心肌组织纤维化修复进程，促损伤心肌组织心功能状态的恢复有积极的参考意义。

（致谢：本文的实验在南阳理工学院医学实验中心完成，实验由杨雷博士和毛秉豫教授共同设计，并进行经费资助。刘暖为实验的主要完成人，徐国昌主要负责统计学工作，叶松山、张培华、张?芳协助进行分子生物学实验。对以上同志的工作特别表示感谢！）

参考文献：

［1］ 杨 雷，毛秉豫，徐国昌，等．黄芪提取物对大鼠心肌梗死后心肌组织PKD1蛋白表达的影响［J］．中国药理学通报，2013，29 （4）：512－9．

［1］ Yang L，Mao B Y，Xu G C，et al．Effect of astragalus extract on the levels of PKD1 protein in rats with myocardial infarction［J］．Chin Pharmacol Bull，2013，29（4）：512－9．

［2］ Wille C，Seufferlein T，Eiseler T．Protein kinase D family kinases：roads start to segregate［J］．Bioarchitecture，2014，4（3）：111－5．

［3］ Palmefors H，DuttaRoy S，Rundqvist B，et al．The effect of physi-cal activity or exercise on key biomarkers in atherosclerosis-a sys-tematic review［J］．Atherosclerosis，2014，235（1）：150－61．

［4］ Liu Z J，Velazquez O C．Hyperoxia，endothelial progenitor cell mobilization，and diabetic wound healing［J］．Antioxid Redox Sig-nal，2008，10（11）：1869－82．

［5］ Balaji S，King A，Crombleholme T M，et al．The role of endothe-lial progenitor cells in postnatal vasculogenesis：implications for therapeutic neovascularization and wound healing［J］．Adv Wound Care（New Rochelle），2013，2（6）：283－95．

［6］ Forstermann U，Sessa W C．Nitric oxide synthases：regulation and function［J］．Eur Heart J，2012，33（7）：829－37．

［7］ Hess C N，Kou R，Johnson R P，et al．ADP signaling in vascular endothelial cells：ADP-dependent activation of the endothelial iso-form of nitric-oxide synthase requires the expression but not the ki-nase activity of AMP-activated protein kinase［J］．J Biol Chem，2009，284（47）：32209－24．

［8］ Ching L C，Kou Y R，Shyue S K，et al．Molecular mechanisms of activation of endothelial nitric oxide synthase mediated by transient receptor potentialvanilloid type 1［J］．Cardiovasc Res，2011，91 （3）：492－501．

［9］ Hao Q，Wang L，Zhao Z J，et al．Identification of protein kinase D2 as a pivotal regulator of endothelial cell proliferation，migra-tion，and angiogenesis［J］．J Biol Chem，2009，284（2）：799－806．

［10］Aicart R C，Sánchez R L，Gómez P M，et al．Protein kinase D ac-tivity controls endothelial nitric oxide synthesis［J］．J Cell Sci，2014，127（Pt 15）：3360－72．

［11］Kentaro J J，Masaaki L，Douglas W L．Endothelial progenitor cells in neovascularization of infracted myocardium［J］．J Mol Cell Car-diol，2008，45（4）：530－44．

Angiogenesis of protein kinase D1 in bone marrow-derived endothelial progenitor cells of rats

LIU Nuan，YANG Lei，MAO Bing-yu，XU Guo-chang，YE Song-shan，ZHANG Pei-hua，ZHANG Li-fang
（Medical Experimental Center，Nanyang Institute of Technology，Nanyang Henan 473004，China）

Abstract：Aim To explore the effect of protein kinase D1（PKD1）on adherence，migration，proliferation，microvascular formation，and eNOS expression in bone marrow-derived endothelial progenitor cells（EPCs）of rats．Method The EPCs were isolated from bone marrow of rats，cultured and detected，the effects of PKD1 and its specific blocking agent CID755673 on adhesion，migration，proliferation，or microvascular formation were observed，as well as mRNA and protein expression of endothelial nitric oxide synthase（eNOS）

in EPCs．Results PKD1 significantly promoted adhe-sion，migration，proliferation and microvascular forma-tion of EPCs，and upregulated the mRNA and protein expression of eNOS in EPCs，according to the cell cul-ture experiments of EPCs in vitro．Conclusion PKD1 has the role of angiogenesis through regulation of EPCs，which might be dependent on eNOS．

Key words：protein kinase D1；endothelial progenitor cells；angiogenesis；endothelial nitric oxide synthase；migration；proliferation

作者简介：刘 暖（1987－），女，硕士，助教，研究方向：心血管疾病发病机制，E-mail：liunuan2006＠126．com；杨 雷（1977－），男，博士，副教授，研究方向：中西医结合抗心血管疾病发病机制，Tel：0377-62071309，E-mail：yanglei200609＠126．com；毛秉豫（1958－），男，博士，教授，研究方向：心血管疾病的气血并治方药，Tel：0377-62071305，E-mail：maobing yu2005＠126．com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No 81473438，81202791，81173372）；河南省中医内科学重点学科支撑课题（豫教高［2012］186号）

收稿日期：2015－05－13，修回日期：2015－06－23

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）09－1259－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．016