促红细胞生成素对肝硬化大鼠心肌TGF-β1 及ColⅠ基因表达的影响

张蔚屏，于 影，高 琴，郭晓磊，关宿东

（蚌埠医学院生理学教研室，安徽蚌埠 233030）

促红细胞生成素对肝硬化大鼠心肌TGF-β1 及ColⅠ基因表达的影响

张蔚屏，于 影，高 琴，郭晓磊，关宿东

（蚌埠医学院生理学教研室，安徽蚌埠 233030）

中国图书分类号：R-332；R322.11；R394.2；R542.202；R575.2；R977.9

摘要：目的 观察肝硬化对大鼠心肌转化生长因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）及胶原Ⅰ（collagenⅠ，ColⅠ）基因表达的影响及促红细胞生成素的干预作用。方法 清洁级SD大鼠36只，随机分为3组：正常对照组、肝硬化组及EPO干预组。在体测定各组心脏血流动力学指标，测血清乳酸脱氢酶（LDH）及肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平，Masson染色法观察各组大鼠心肌胶原形成情况，RT-PCR法检测各组心肌TGF-β1、ColⅠmRNA基因表达的变化。结果 与正常对照组相比，肝硬化组大鼠左心室收缩和舒张功能下降，心肌酶增高，心肌胶原沉积明显增加，心肌TGF-β1及ColⅠ基因表达升高。与肝硬化组相比，EPO干预组大鼠心室收缩和舒张功能提高，心肌酶指标降低，心肌胶原沉积改善，心肌TGF-β1及ColⅠ基因表达降低。结论肝硬化能引起大鼠心肌结构和功能的改变，促进心肌间质纤维化的发生；EPO对肝硬化大鼠心肌损伤有一定的保护作用。

关键词：肝硬化；心肌；EPO；胶原；心功能；TGF-β1

网络出版时间：2015－9－14 14：53 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．030．html

1953年Kowalski等［1］首次报道肝硬化患者存在心功能异常，肝硬化引起长期的高动力循环及一

系列神经体液因素的共同作用造成心室负荷加重、钠水潴留、心肌的相对供血不足，导致心肌细胞肥大和心肌间质纤维化即心室重构，许多因子及信号通路参与心室重构的致病过程，其中转化生长因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）信号通路在心肌肥大及心肌间质纤维化的过程中发挥重要的作用，是诸多因素导致心肌纤维化共同的中介物之一。促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）作为一种造血因子已应用于临床，近年来研究表明，EPO可激活多种细胞信号转导通路发挥促进新生血管生成，对抗细胞凋亡、氧化应激、减轻炎症反应，抑制纤维生成等作用。目前尚未见关于EPO对肝硬化心肌纤维化干预作用的报道。本实验旨在观察肝硬化对大鼠心肌功能的影响，在此基础上给予一定剂量EPO的干预，初步探讨EPO对肝硬化心肌的抗纤维化作用及其和TGF-β1之间的关系，为临床降低和改善肝硬化患者可能出现的心脏并发症提供一定的实验依据和治疗方向。

1　材料与方法

1．1材料 健康Sprague-Dawley大鼠36只，质量180～220g，购于蚌埠医学院实验动物中心。四氯化碳（分析纯，天津博迪化工股份有限公司出品），胆固醇（Sigma公司出品），RT-PCR引物、溴化乙锭（EB）、DEPC（焦碳酸二乙酯）、琼脂糖等购于上海生工生物工程公司，Beyozol 100 mL／瓶（碧云天公司出品），逆转录试剂盒及PCR扩增试剂盒（Fermentas公司），玉米面、白酒等为当地超市所购，其它常用试剂为国产分析纯。

1．2方法

1．2．1实验分组、模型建立与给药 ♀SD大鼠36只，适应性饲养1周，给予普通饲料与自来水喂养，随机分为3组，正常对照组（normal组，n＝10），肝硬化模型组：（liver cirrhosis，LC组，n＝13），肝硬化＋EPO干预组（liver cirrhosis＋erythropoietin，LC＋EPO干预组，n＝13），正常对照组大鼠腹部皮下注射等量的生理盐水，给予普通饲料和自来水；其余各组大鼠每隔3天腹部皮下多点注射CCl4玉米油溶液，同时给予0.59 mol·L－1乙醇饮用［2］，第5周开始，肝硬化＋EPO干预组大鼠腹腔注射重组人红细胞生成素（rhEPO），2 000 IU·kg－1，每周2次，共4周至建模结束。第9周各组随机抽出两只大鼠，水合氯醛300 mg·kg－1腹腔注射麻醉，打开腹腔取肝脏，多聚甲醛固定，24 h后石蜡包埋，切片进行HE染色，光镜下观察显示肝硬化模型建立成功。

1．2．2左心室血流动力学指标 腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，置于手术台上，仰卧固定，颈部正中切开，气管插管，接小型动物呼吸机，吸气：呼气为1∶1，潮气量2－3 mL／100 g，呼吸频率75 times· min－1，分离右侧颈总动脉，心室内插管，与Medlab生物信号采集处理系统相连，平衡30 min，实时监测左心室峰压（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室内压最大上升速率（＋dp／dtmax）和左心室内压最大下降速率（－dp／dtmax）等各项指标。

1．2．3血清心肌酶学测定 各组大鼠心室血流动力学指标检测完毕后，打开腹腔，腹主动脉取血约5 mL，室温放置30 min后，3 000 r·min－1离心15 min，收集血清，取血清约500 μL自然解冻后，采用全自动生化分析仪测定LDH、CK-MB含量。

1．2．4心肌Masson染色 取相同部位心肌组织，10%甲醛溶液中固定，24 h后无水乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，病理切片机切5 μm厚，进行Masson染色，光镜下观察。

1．2．5RT-PCR方法检测TGF-β1和ColⅠmRNA表达 取心肌组织约100 mg，匀浆器研磨，加Beyo-zol试剂1 000 μL，用以提取心肌组织总RNA，提引物3 μL，按照逆转录试剂盒和PCR试剂盒要求分别加入上下游引物，于PCR仪上进行扩增，TGF-β1扩增条件：95℃预变性3 min后，以①95℃，50 s变性；②退火温度58℃，45 s；③72℃，60 s反应，30个循环，最后一轮延10 min。ColⅠ扩增条件：95℃预变性4 min后，以①94℃45 s变性；②退火温度57℃，45 s；③72℃，60 s反应35个循环，最后一轮延伸10 min。结果以目的产物与内参扩增产物的比值作为表达量（附各种基因引物序列，见Tab 1）。

Tab 1 Primer squences for each gene

2　结果

2．1左心室功能变化 与正常组相比，肝硬化组LVSP、＋dp／dtmax、－dp／dtmax均明显降低（P＜0.01）；与肝硬化组相比，肝硬化＋EPO干预组

LVSP、＋dp／dtmax、－dp／dtmax明显增高（P＜0.05～P ＜0.01）（Tab 2）。

Tab 2 Hemodynamic LVSP，＋dp／dtmax，－dp／dtmaxparameters in different groups（±s，n＝8）

Tab 2 Hemodynamic LVSP，＋dp／dtmax，－dp／dtmaxparameters in different groups（±s，n＝8）

1 mmHg＝0.133 kPa；P＜0.05，P＜0.01 vs normal group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs LC

Group　LVSP ／mmHg ＋dp／dtmax／mmHg·s－1－dp／dtmax／mmHg·s－1Normal　110．15±21．93　4173．47±942．48　3305．00±1006．10 LC　78．78±10．252554．86±553．421855．48±323．22LC＋EPO　98．77±13．47＃　3457．08±566．25＃　2982．55±694．48＃＃

2．2心肌酶学改变 与正常对照组相比，肝硬化模型组大鼠心肌LDH、CK-MB均明显升高（P＜0.01），与肝硬化模型组相比，肝硬化＋EPO干预组各项心肌酶指标有一定程度降低（P＜0.05），但高于正常对照组（P＜0.05）（Fig 1）。

Fig 1 Changes of LDH，CK-MB content in different groups

2．3心脏Masson染色 Masson染色显示心肌细胞呈红色，细胞间质中的胶原纤维呈蓝色。正常对照组：心肌纤维红染，排列整齐，走向规则，未见肌丝断裂，细胞间隙均匀，可见少量纤维组织，少许间质蓝染；肝硬化模型组：心肌纤维排列紊乱，间质水肿，增生明显，出现较多蓝染的胶原纤维蓄积；肝硬化＋EPO干预组：心肌细胞排列较整齐，间质增生减轻，有部分胶原纤维蓄积，较肝硬化模型组有改善（Fig 2）。

Fig 2 Histopathology changes of myocardium in every group（masson staining，×400）

2．4心肌组织中TGF-β1和ColⅠmRNA的表达

与正常组相比，肝硬化组心肌组织TGF-β1mRNA水平明显上调（P＜0.01），ColⅠmRNA水平明显上调（P＜0.01），与肝硬化组相比，肝硬化＋EPO干预组TGF-β1mRNA水平下调（P＜0.05），ColⅠmRNA水平下调（P＜0.05）（Fig 3，4）。

3　讨论

1953年Kowalski等［1］首次报道肝硬化患者存在心功能异常。随后大量的动物实验及临床报道显示肝硬化损伤心脏的收缩和舒张功能［3－4］。目前研究显示肝硬化引起心肌损伤的主要机制可能与β肾上腺素受体表达下调、肾素－血管紧张素－醛固酮系统高度激活、长期高动力循环状态、内源性大麻素及炎症介质增加、心肌细胞膜胆固醇／磷脂比例失调和离子通道改变等有关［5－6］。由于一系列神经体液因素的共同作用造成心室负荷加重、钠水潴留、心肌的相对供血不足从而造成心肌细胞肥大和心肌间质纤维化即心室重构，心室重构是肝硬化心脏功能出现减退的比较明确的病理改变［7］。

实验中观察到，肝硬化大鼠在体心室血流动力学发生了改变：LVSP和±dp／dtmax都有明显降低，提示肝硬化大鼠心脏收缩和舒张功能均受到到损伤，心肌泵血功能减弱。LDH和CK-MB是反映心肌细

胞损伤较为敏感的酶学指标。正常情况下，它们大多在细胞内、血中含量较少，肝硬化造成长期高动力循环以及一系列的神经体液因素，导致心肌能量消耗剧烈，局部耗氧增多，心肌细胞内线粒体负荷过重，大量自由基产生，引发功能紊乱，对心肌细胞的正常结构和功能起直接的损伤作用，同时膜通透性增加，细胞内蛋白漏出。肝硬化时其值的增高，也更加说明了肝硬化损伤了心肌结构的完整性。

Fig 3 Changes in TGF-β1mRNA and ColⅠmRNA of different groups

Fig 4 TGF-β1 mRNA，ColⅠmRNA agarose gel electrophoresis of different groups

心肌间质纤维化是造成心肌功能损害的重要因素之一。正常时心肌间质胶原纤维的合成与降解速度几乎相等，以保持胶原含量的稳定。一旦二者之间的动态平衡破坏，就会引起心室重构，最终导致功能障碍。本实验通过Masson三色染色法及RT-PCR观察到肝硬化时，心肌间质中胶原沉积明显增多，Ⅰ型胶原表达增强，心肌僵硬度增加，顺应性降低，造成舒张功能障碍；同时，胶原含量的增加使心肌细胞被增生的胶原包围和封闭，影响心肌细胞力的产生与传递，诱发收缩功能障碍。

心肌纤维化的形成是一个缓慢的动态过程，涉及到细胞、细胞因子和ECM等多种因素、多环节间相互作用和相互调节，具体机制尚不明确。已有的急、慢性动物心肌损伤模型研究显示，心肌肥大和心肌纤维化往往伴随有TGF-β1基因表达的上调［8］，而且利用TGF-β1抗体中和TGF-β1也可使心肌纤维化减轻［9］。本实验利用RT-PCR法观察到肝硬化组心肌的TGF-β1 mRNA表达明显高于正常对照组，推测TGF-β1可能参与促进肝硬化心肌ColⅠ的生成，促进心肌间质细胞生成，加速了肝硬化心肌间质纤维化，影响到心室重构，从而减弱了心脏的功能。

促红细胞生成素是一种由肾脏分泌的酸性糖蛋白，可以调节红系祖细胞增殖、分化和成熟，临床上一直广泛用于治疗各种原因所造成的贫血。近年来陆续有报道EPO及其衍生物在心血管疾病中的保护作用，并认为调节炎症、抑制心室重构以及促血管生成作用可能是EPO能够用于心脑血管疾病治疗的基础［10－11］。最新资料显示，EPO能通过降低肿瘤坏死因子及白介素的活性而提高肝硬化心肌的收缩和舒张功能［12］，且研究显示EPO对多种原因造成的心肌纤维化都有一定的改善作用［13］，但具体机制尚不明确。本实验观察到，一定剂量的EPO干预后，EPO可以在一定程度上提高肝硬化大鼠心室血流动力学指标，增加肝硬化左心室的收缩力，改善心肌舒张功能；同时降低了LDH和CK-MB的水平，提示EPO可以减轻心肌细胞生物膜结构损伤，使胞质内酶释放减少，从而降低心肌的损伤程度；TGF-β1 和ColⅠ表达水平下调进一步证明了EPO可以减少Ⅰ型胶原的形成，降低心肌间质的纤维化程度，改善

左室重构，恢复心肌顺应性，发挥其对肝硬化心肌损伤的干预作用。

综上所述，肝硬化可引起心肌结构和泵血功能发生变化，诱发心室重构，而TGF-β1的高表达对肝硬化心室重构起着非常重要的作用。EPO作为细胞保护因子，可以一定程度地减轻肝硬化对心肌的损伤，降低间质纤维的增生，改善心室重构，TGF-β1及其下游的分子信号传导通路可能参与了这一过程，具体的机制还有待于进一步的研究和探讨。

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Effects of EPO on expression of TGF-β1 and ColⅠin myocardium of liver cirrhosis rats

ZHANG Wei-ping，YU Ying，GAO Qin，GUO Xiao-lei，GUAN Su-dong
（Dept of Physiology，Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233030，China）

Abstract：Aim To observe the effects of liver cirrho-sis on the expression of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）and ColⅠin rat myocardium and interven-tion of erythropoietin（EPO）．Methods Thirty-six male Sprague-Dasley rats were randomly divided into three groups：control group，liver cirrhosis group and EPO group，then the cardic hemodynamic parameters in vivo and levels of serum lactate dehydrogenase （LDH）as well as creatine kinase isoenzyme（CK-MB）were measured．With Masson′s trichrome stain，changes of collagen formation of myocardial tissue in different groups were observed．Also the mRNA ex-pressions of TGF-β1 and ColⅠin myocardium were de-tected by RT-PCR．Results In contrast to control group，rats in liver cirrhosis group showed a decline in systolic and diastolic function of left ventricule，rising myocardial enzyme，a distinct increase of cardiac colla-gen deposition，as well as an elevation of TGF-β1 and ColⅠmRNA expressions．In contrast to liver cirrhosis group，rats in EPO group demonstrated an improve-ment in systolic and diastolic function of left ventricule as well as in cardiac collagen deposition，and a de-crease in both myocardial enzyme and TGF-β1 and Col ⅠmRNA expressions．Conclusion Liver cirrhosis can lead to the changes of myocardial structure and function in rats，and it can accelerate myocardial inter-stitial fibrosis；EPO can protect the myocardial injury in liver cirrhosis rats．

Key words：liver cirrhosis；myocardium；EPO；colla-gen；cardiac function；TGF-β1

作者简介：张蔚屏（1981－），女，硕士，讲师，研究方向：心血管生理学，Tel：0552-3175269，E-mail：wpzhang982003＠aliyun．com；关宿东（1961－），男，教授，研究方向：损伤与修复，通讯作者，Tel：0552-3175270，E-mail：guansdbbmc＠163．com

基金项目：安徽省高等学校自然科学研究项目（KJ2015B058by）；安徽省自然科学基金资助项目（No 1508085QH150）

收稿日期：2015－06－20，修回日期：2015－08－09

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）10－1398－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．015