辛伐他汀通过Akt／eNOS途径改善心肌梗死后急性期心功能

朱乔燕，王光宇，2，毕亚光，2，张庆勇，魏 盟

（1．上海市第六人民医院心血管内科，上海 200233；2．上海交通大学医学院，上海 200233）

辛伐他汀通过Akt／eNOS途径改善心肌梗死后急性期心功能

朱乔燕1，王光宇1，2，毕亚光1，2，张庆勇1，魏 盟1

（1．上海市第六人民医院心血管内科，上海 200233；2．上海交通大学医学院，上海 200233）

中国图书分类号：R-332；R322．11；R331．31；R542.22；R972.6

摘要：目的 探讨辛伐他汀（simvastatin，Sim）对急性心肌梗死后心肌内源性抗氧化系统的影响及其潜在机制。方法应用结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法模拟急性心肌梗死（AMI），随机分为心肌梗死组（MI）组和辛伐他汀组（Sim，20 mg·kg－1·d－1），另设假手术组（Sham组）。Sim组连续灌胃7 d，MI组和Sham组给予等剂量的生理盐水灌胃。7 d后，观察心肌血流动力学参数变化；检测血脂及心肌坏死标记物肌钙蛋白I（c-TnI）和乳酸脱氢酶（LDH）变化；ELISA法检测心肌抗氧化系统超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GP）水平。Western blot检测心肌p-Akt／p-eNOS蛋白表达变化。结果 急性心肌梗死明显降低心肌血流动力学参数，增加血清c-TnI和LDH水平，降低SOD及GP水平，降低p-Akt和p-eNOS蛋白表达。Sim组能明显改善急性期心功能恶化，减低血清c-TnI和LDH水平，增加SOD及GP水平，增加p-Akt和p-eNOS蛋白表达。结论 急性心肌梗死后早期应用Sim能明显改善心功能，增加心肌抗氧化系统活性，减少心肌坏死，这可能与提高p-Akt和p-eNOS蛋白表达有关。

关键词：辛伐他汀；心肌梗死；心功能；氧化应激；急性期；p-Akt；p-eNOS

网络出版时间：2015－9－14 14：53 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．020．html

他汀类药物（statins），羟甲基戊二酰辅酶A （HMG-CoA）还原酶抑制剂，已成为临床上治疗高脂血症和降低心血管疾病发病率及死亡率的一线药物。大型临床数据研究发现，急性心肌梗死后（AMI）早期使用他汀类药物能明显提高AMI后1年生存率［1］。近年研究发现，他汀类药物的一些额外收益并非完全归功于其降低血脂作用［2］。临床数据和基础实验已经证实在发生心衰情况下，活性氧类物质增多，其参与脂质过氧化物的形成，破坏细胞膜，降低内源性的抗氧化防御系统［3－4］。因此，通过有效的干预手段抑制自由基的产生或增强抗氧化防御系统或许可以改善心功能。

近来实验发现，丝氨酸／苏氨酸激酶（Akt）及其下游靶蛋白eNOS（内皮型一氧化氮合酶）参与调控缺血组织血管再生及改善缺血组织血流动力学异常改变［5－7］。但是在AMI情况下，辛伐他汀对内源性抗氧化系统的影响还鲜有报道，同时对他汀类药物心肌保护作用的研究大多数集中在心梗后重构期［8］。所以本实验制作大鼠急性心肌梗死模型，观察辛伐他汀对急性期内源性抗氧化系统的影响及其与Akt／eNOS通路的关系，探讨辛伐他汀改善心肌梗死后急性期心功能的潜在分子机制。

1　材料与方法

1．1药物与试剂 辛伐他汀（批号100035）由默沙东公司提供；抗磷酸化的Akt（p-Aktser473）及磷酸化的eNOS（p-eNOSser1177）购自Cell Signaling Technolo-gy公司；BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天公司；化学发光试剂购自Millipore公司。SOD与GP试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1．2动物模型建立与分组 健康SD♂大鼠（上海西普尔－必凯实验动物有限公司提供），体质量200 ～250 g。将5%戊巴比妥钠（40 mg·kg－1）腹腔注射麻醉大鼠，背位固定，行气管切开并连接到微型动物呼吸机（ALC-V8，上海奥尔科特生物科技有限公司）行呼吸支持，使用GE Pruka Mac-Lab2000心电生理工作站（GE，美国）实时记录常规肢体导联及V1、V3、V6胸前导联心电图。于大鼠胸骨左缘第3 －4肋间开胸，暴露心脏，剪开心包膜，于左心耳及肺动脉圆锥之间距左心耳下缘1－2 mm处穿线（6／0丝线）结扎冠状动脉左前降支。结扎成功的标志：心电图Ⅱ导联J点明显抬高和结扎线以下心肌组织颜色由正常变苍白。另设假手术组（Sham组，n＝12），在相同位置只挂线不结扎。24 h后存活的SD大鼠随机分为心肌梗死组（MI组，n＝12），辛伐他汀组（Sim组，n＝12，20 mg·kg－1·d－1），剂量参考文献［8］。Sim组术后24 h以辛伐他汀（批号100035，默沙东公司）灌胃，连续7 d。Sham组和MI

组以等量的生理盐水灌胃。

1．3血流动力学测定 7 d后以同样的方法进行腹腔麻醉。分离右颈总动脉，经右颈总动脉插入PE-20导管至左心室，导管另一端经能量转换器连接MPA-2000生理记录仪，测定心率（HR）、左室收缩压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室压力最大上升和下降速率（±LVdp／dtmax）。

1．4血脂、心肌损伤标记物及抗氧化系统标记物测定 血流动力学测定完之后开腹，在腹腔静脉处取血5 mL，离心取上清送至上海市第六人民医院检验科，测定胆固醇（TG）、甘油三酯（TC）、肌钙蛋白I （c-TnI）、乳酸脱氢酶（LDH）水平，同时用ELISA试剂盒测定超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GP）水平。

1．5Western blot检测心肌p-Akt／p-eNOS的表达提取心肌蛋白样本，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，调至等浓度后加入上样缓冲液混合，离心后上样。恒压80 V电泳，30 min后改为恒压120 V至电泳结束。将蛋白转至PVDF膜上（恒流250 mA，4℃转膜2 h），用5%脱脂奶粉室温封闭3 h，加入相应一抗，在摇床上4℃孵育过夜，0.1%TBST洗膜3次后加相应二抗室温孵育2 h，洗膜后显色，使用凝胶成像系统拍照分析，计算各条带OD值，以靶蛋白与内参蛋白的OD值比值代表相应蛋白的表达量。

1．6统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用方差检验，两两比较分析采用LSD-q检验。

2　结果

2．1各组血流动力学比较 与Sham组相比，MI组LVEDP明显升高，LVdp／dtmax，LVdp／dtmin及LVSP却明显降低（P＜0.05）。与MI组相比，Sim组明显改善心功能，逆转血流动力学这些异常指标（P＜0.05）。HR在各组间差异无统计学意义（P＞0.05），见Tab 1。

2．2各组大鼠血脂比较 与Sham组相比，MI组TG和TC均呈上升趋势，但差异未达到统计学意义（P＞0.05）。与MI组相比，Sim组TG和TC呈下降趋势，差异也未达到统计学意义（P＞0.05）。

2．3各组心肌损伤标记物及抗氧化系统标记物测定 与Sham组相比，MI组血清c-TnI和LDH水平明显升高（P＜0.05），与MI组相比，Sim组c-TnI和LDH水平明显降低（P＜0.05），但较Sham组升高（P＜0.05）。与Sham组相比，MI组血清SOD和GP水平明显降低（P＜0.05），与MI组相比，Sim组SOD和GP水平明显升高（P＜0.05），但较Sham组降低（P＜0.05），见Tab 2。

Fig 1 Effect of simvastatin on lipid level in rats（n＝12）

2．4Western blot检测各组心肌p-Akt和p-eNOS水平变化 与Sham组相比，MI组p-Akt水平明显降低（P＜0.05），与MI组相比，Sim组p-Akt水平明显升高（P＜0.05）。与Sham组相比，MI组p-eNOS水平明显降低（P＜0.05），与MI组相比，Sim组p-eNOS水平明显升高。

Tab 1 Effect of simvastatin on hemodynamics parameters in rats（±s，n＝12）

Tab 1 Effect of simvastatin on hemodynamics parameters in rats（±s，n＝12）

P＜0.05 vs Sham group；＃P＜0.05 vs MI group

Group　LVSP／kPa　LVEDP／kPa　LVdp／LVdtmax／kPa·s－1　LVdp／LVdtmin／kPa·s－1　HR／bpm·min－1Sham　15．86±0．98　0．39±0．09　1243．82±104．51　810．06±78．51　438．00±5．20 MI　12．26±0．88　0．77±0．15　739．95±28．39　574．12±30．66　456．00±19．40 Sim　15．32±0．79＃　0．43±0．11＃　1179．44±79．98＃　785．27±94．78＃451．00±13．10

Tab 2 Effect of simvastatin on myocardial injury and antioxidant system markers in rats（±s，n＝12）

Tab 2 Effect of simvastatin on myocardial injury and antioxidant system markers in rats（±s，n＝12）

P＜0.05 vs Sham；＃P＜0.05 vs MI

Group　c-TnI／ng·L－1LDH／U·L－1SOD／U·L－1　GP／U·L－1Sham　750±230　6122±120　325±15　8327±674 MI　18210±8670　8562±236　184±21　5458±745Sim　8530±3960＃　7383±153＃　241±14＃　7247±695＃

Fig 2 Effect of simvastatin on p-Akt and p-eNOS expression in rats（n＝12）

3　讨论

本实验观察到急性心肌梗死后急性期心功能明显降低，LVSP，±LVdp／LVdtmax明显降低，LVEDP升高，用辛伐他汀20 mg·kg－1连续灌胃7 d可以明显改善心功能。急性心肌梗死后，细胞坏死释放大量肌钙蛋白I［9－10］，急性心肌梗死后使用辛伐他汀可以明显降低c-TnI水平［11］。LDH也是诊断心肌损伤的标志物，当细胞膜通透性升高或者破裂，胞质内的LDH就会释放到细胞外，血清浓度也随之升高。前期研究也表明发生心肌梗死大鼠，血清LDH浓度会明显升高，本次研究结果和前期研究结果一致［12］。使用辛伐他汀可以明显减少LDH水平，表明辛伐他汀可以保持细胞膜完整性，从而限制胞质内LDH外溢。所以，辛伐他汀改善心功能或许和稳定细胞膜完整相关，减少心肌细胞的破坏。

急性心肌梗死可引起严重的氧化应激反应，进而导致心肌细胞的坏死。活性氧类物质的增多或者抗氧化防御系统能力的减弱都会加重心肌细胞的坏死，加重心肌病理生理变化［13］。Zhou等［14］报道氟伐他汀可以减少心肌细胞氧化物质产生，增加抗氧化系统性能。这和此次试验结果一致，SOD和GP 在MI组都明显降低，辛伐他汀处理可以明显提升SOD和GP水平，表明急性期使用辛伐他汀可以增强内源性抗氧化防御系统，加快应激状态下自由基的清除，减少心肌损伤，从而改善心梗急性期心功能，此外也表明辛伐他汀的心脏保护作用机制可能与增加SOD和GP水平有关。

蛋白激酶B（PKB／Akt）是一种多功能调控因子，参与内皮细胞的生长、生存等调节。在缺血／再灌注动物模型中，激活Akt可以减少心肌细胞凋亡［15］。Kureishi等［7］研究表明，在正常血脂的动物中，辛伐他汀可以明显改善缺血肢体的血流动力学参数，促进血管再生。进一步研究发现，Akt／eNOS信号通路在此过程中扮演着举足轻重的作用。在本次实验中，我们也观察到辛伐他汀改善急性期心肌梗死大鼠血流动力学参数，同时也发现辛伐他汀组提高p-Akt和p-eNOS水平。所以据此推测辛伐他汀促进心梗后大鼠心肌Akt激活，从而使血管内皮细胞生成NO增加，促进血管扩张，增加缺血心肌的灌注，从而改善心功能。NO还可以抑制血小板的聚集、炎症反应和平滑肌细胞增殖。此外，Akt是血管内皮细胞生长因子（VEGF）下游靶蛋白，在Kure-ishi等研究中发现激活Akt发挥血管再生作用，因此，在本次实验中不能排除Akt也发挥同样的作用进而改善心功能。故激活Akt途径加快再内皮化和增加NO合成体现了心肌梗死早期使用他汀类药物保护益处。总之，这些潜在的心脏保护作用机制或许可以部分解释辛伐他汀改善急性期心功能的分子机制。当然还有其他许多机制，如辛伐他汀减少心梗后心肌细胞凋亡和减轻心肌细胞水肿参与心功能

的改善［16］。

综上所述，本实验证实辛伐他汀对心肌梗死大鼠急性期具有重要的保护作用，增加血清SOD和GP水平，降低c-TnI和LDH水平和激活Akt／eNOS信号通路都参与其中。这为早期使用他汀类药物治疗急性心肌梗死改善心功能提供了重要的实验依据。至于辛伐他汀调节Akt磷酸化和Akt促进eNOS磷酸化增加NO释放的具体过程还是不清楚，需要以后的进一步研究。

（致谢：本文所有实验过程及数据都是在上海市第六人民医院心血管内科实验室完成，在此感谢实验室研究员卿艳维老师在实验中给予的帮助。）

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Simvastatin improves cardiac function in acute phase after myocardial infarction through Akt／eNOS pathway

ZHU Qiao-yan1，WANG Guang-yu1，2，BI Ya-guang1，2，ZHANG Qing-yong1，WEI Meng1
（1．Cardiovascular Dept，the Sixth People’s Hospital of Shanghai，Shanghai 200233，China；2．Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200233，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of simvastatin （Sim）on endogenous antioxidant system after acute myocardial infarction（AMI）and its potential mecha-nisms．Methods The acute myocardial infarction （AMI）rat models were made by ligation left anterior descending of coronary artery．Then the successful models were randomly divided into myocardial infarc-tion group（MI group）and simvastatin group（Sim，20 mg·kg－1·d－1），another group without ligation left anterior descending of coronary artery served as sham group（Sham group）．The Sim group was administered simvastatin by gavage for 7 days．MI group and Sham

group received saline．Hemodynamic parameters，lipid levels，troponinI（c-TnI）and lactate dehydrogenase （LDH）concentrations were examined after 7days，and the levels of superoxide dismutase（SOD）and glutathi-one peroxidase（GP）of myocardial antioxidant system were detected by ELISA．The expression of cardiac p-Akt and p-eNOS protein were detected by Western blot．Results Acute myocardial infarction significant-ly lowered cardiac hemodynamic parameters，increased serum c-TnI and LDH levels，lowered levels of SOD and GP，and lowered the expression of p-Akt and p-eNOS protein．However，Sim could effectively prevent the deterioration of cardiac function，reduce serum c-TnI and LDH levels，increase levels of SOD and GP，and increase p-Akt and p-eNOS protein expression．Conclusion Early using Sim can effectively improve heart function after acute myocardial infarction，acti-vate myocardial antioxidant system，and reduce myocar-dial necrosis，which may be related to increasing the expression of p-Akt and p-eNOS．

Key words：simvastatin；myocardial infarction；cardi-ac function；oxidative stress；acute phase；p-Akt；p-eNOS

作者简介：朱乔燕（1981－），女，硕士，研究方向：心律失常发病机制，E-mail：513387804＠qq．com；张庆勇（1972－），男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：糖尿病心律失常发病机制，E-mail：zhang＿qingyong71＠hotmail．com

基金项目：上海自然科学基金资助项目（No 13ZR1431500）

收稿日期：2015－05－11，修回日期：2015－08－16

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）10－1375－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．010