ID1在3种胶质母细胞瘤细胞系中的表达及其意义

任　力, 魏子龙, 邱永明, 兰　津, 郭　品

(1. 上海市浦东医院 神经外科, 上海, 201399; 2. 上海交通大学医学院附属仁济医院 神经外科, 上海, 200127)

ID1在3种胶质母细胞瘤细胞系中的表达及其意义

任力1, 魏子龙1, 邱永明2, 兰津2, 郭品2

(1. 上海市浦东医院 神经外科, 上海, 201399; 2. 上海交通大学医学院附属仁济医院 神经外科, 上海, 200127)

摘要:目的研究DNA结合分化抑制因子1(ID1)在3种胶质母细胞瘤细胞系中的表达水平，探讨其表达水平差异与放疗敏感性之间可能存在的联系。方法利用Real-time PCR以及蛋白质印迹法分别检测T98G、A172、U251 这3种胶质母细胞瘤细胞系中ID1的mRNA以及蛋白表达水平，比较其表达差异。结果3种胶质母细胞瘤细胞中, IDl mRNA表达情况为T98G

关键词:DNA结合分化抑制因子; 胶质母细胞瘤; 放疗敏感性; 蛋白质印迹法

胶质母细胞瘤是星形细胞肿瘤中恶性程度最高的胶质瘤，属WHO IV级，占成人颅内肿瘤的25%。胶质母细胞瘤生长速度快、病程短、预后差，病程超过1年者仅占10%。胶质母细胞瘤以手术、放疗、化疗及其他综合治疗为主，放射治疗是治疗胶质母细胞瘤的主要手段之一，但在不同患者中疗效差异较大，这可能与肿瘤细胞对辐射的敏感性不同有关，这也被称为辐射敏感性差异[1]。在作者先前的研究中发现，3种胶质母细胞瘤细胞系对放射治疗的敏感性为: T98G

1材料与方法

1.1　材料

实验所用的人脑胶质母细胞瘤细胞A172、T98G、U251购自美国菌种保藏中心(ATCC)。T98G培养基为含10%胎牛血清的MEM培养液，购自Invitrogen公司。A172和U251培养基为含10%的胎牛血清的DMEM培养液，购自Invitrogen公司。Trizol总RNA提取试剂、RT-PCR试剂盒(BcaBESTTM RNA PCR Kit和SYBR Premix Ex TaqTM)均购于Takara公司；Real-time PCR引物由Takara公司设计合成。DEPC水自行配制，高压灭菌，室温保存。胰蛋白酶、DMSO、抗生素(青霉素、链霉素等)购自美国Solarbio公司。ECL显色试剂盒购自美国Pierce公司, NC膜购自密理博公司，暗盒、胶片、显色液等购自碧云天公司。IDl抗体购自美国Santa Cruze公司。

1.2　方法

1.2.1细胞培养：所有细胞都置于5% CO2培养箱中37 ℃培养。培养上述3种细胞A172、T98G、U251，使之处于对数生长期的阶段。

1.2.2Real-time PCR法检测3种人脑胶质母细胞瘤细胞中IDl mRNA的相对定量：目的基因IDl扩增引物序列为正向5′-ACGACATGAACGGCTGTTACTCAC-3′，反向5′-CTCCAACTGAAGGTCCCTGATGTAG-3′, 125 bp。内参基因β-actin的扩增引物序列为正向5′-ATTGCCGACAGGATGCAGA-3′, 反向5′-GAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3′, 89 bp。按标准方法提取总RNA, 反转录合成cDNA，Real-time PCR反应及融解曲线分析，计算mRNA的相对定量。

1.2.3蛋白质印迹法检测3种人脑胶质母细胞瘤细胞中IDl蛋白的表达：胰蛋白酶、DMSO、抗生素(青霉素、链霉素等)购自美国Solarbio公司。ECL显色试剂盒购自美国Pierce公司, NC膜购自密理博公司，暗盒、胶片、显色液等购自碧云天公司。IDl抗体购自美国Santa Cruze公司。待细胞长满后，将细胞用预冷的PBS洗3次，每孔加入30 μL细胞裂解液，冰上裂解30 min, 4 ℃, 12 000 g离心20 min, 将上清转移到新的EP管中。用考马斯亮蓝法(Brandford)测定蛋白含量。15% SDS-聚丙烯凝胶(PAGE)电泳，转膜，膜的封闭，抗原抗体反应，扫膜。

2结果

3种细胞系中，IDl mRNA表达情况为T98G

图1 3种细胞系中ID1的mRNA的表达情况

图2 3种细胞系中ID1蛋白的表达情况

3讨论

放射治疗是治疗胶质母细胞瘤的主要手段之一[7]，如何增强此类患者的放射治疗效果是当前相关领域的研究热点之一[8]。最初主要从放射剂量的角度考虑来增强放射治疗效果，当放射剂量从50 Gy增加到60 Gy的时候，治疗效果有明显提高。而从60 Gy提高到70 Gy的时候，放射治疗的效果无明显改善。所以，试图单纯从提高剂量这个角度，无法增强放射治疗的效果。随着分子生物学以及肿瘤基因学的不断进展，寻找新的肿瘤治疗靶点成为目前研究者关注的重点[9]。对影响放射治疗敏感性的相关因子研究成为近年来肿瘤放射治疗的热点之一。在对胶质母细胞瘤放射治疗的研究中，亦是如此[10]。

众所周知，同一辐射剂量对不同细胞造成的损伤有很大的不同。在相同剂量照射下，不同的细胞所受的损伤会有所不同，这可能与细胞对辐射的敏感性不同造成的，这也被称为辐射敏感性差异[10]。因此患不同肿瘤的患者，甚至患有同一种类型肿瘤的不同患者，其放疗疗效也大不相同。如能在放疗前预先知道其辐射敏感性的高低，则有利于放疗方案的制定和决策，从而有针对性地提高各个患者的疗效，并可更合理的分配医疗资源。因此，研究肿瘤细胞中与放疗敏感性相关的因素就显得尤为重要。

ID蛋白是螺旋-环-螺旋(HLH)转录因子家族成员之一，它与碱性HLH蛋白等转录因子结合成异二聚体后，抑制bHLH与DNA的结合，下调转录因子的活性，从而抑制细胞分化，促进细胞增殖[11]。ID蛋白通常分布于胚胎及未分化成熟的组织中，成人体内在胸腺、生殖腺中有微量表达，正常细胞内蛋白量随着细胞分化过程逐渐降低。早期关于ID蛋白的研究主要集中于它对细胞分化的调节作用，但是随着研究的不断深入，人们发现ID蛋白在多种恶性肿瘤中呈异常高表达趋势，且其表达水平与肿瘤细胞的恶性程度、肿瘤的发展及不良预后密切相关，提示恶性肿瘤ID基因的表达异常，可能是肿瘤侵袭性表型、预后差的标志，并有望成为肿瘤治疗的靶标[12-13]。ID1是目前研究的最多最深入的蛋白，在许多原始的成纤维细胞中，ID1通过激活Ras/Raf/MEK途径促进增殖从而逃避衰老[14]。ID1蛋白异常表达于多种肿瘤组织中，与肿瘤的生长、侵袭、血管生成及预后等密切相关[4]。在各类肿瘤细胞中，ID1都是肿瘤增殖的正性调控基因，可通过抑制细胞分化，促进细胞增殖[15]。

本研究从mRNA水平、蛋白质水平双重证实3种胶质母细胞瘤细胞系中ID1的表达情况为：T98G

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Expression and its significance of ID1

in three types glioblastoma cell line

REN Li1, WEI Zilong1, QIU Yongming2, LAN Jin2, GUO Pin2

(1.DepartmentofNeurosurgeryShanghaiPudongHospital,Shanghai, 201399; 2.Department

ofNeurosurgeryRenjiHospitalAffiliatedtoSchoolofMedicineinShanghaiJiaotong

University,Shanghai, 200127)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression level of Inhibitor of DNA-binding-1/ inhibitor of differentiation-1 (ID-1) in glioblastoma cell line and to analyze the relationship between ID-1 expression level and radiosensitivity. MethodsReal-time PCR and immunoblotting were used to detected the expression level of ID1 in 3 kinds of glioblastoma cell line (T98G, A172 and U251) and the expression differences were compared. ResultsThe sequence of the mRNA expression level of ID1 in 3 kinds of glioblastoma cell line was T98G

KEYWORDS:Inhibitor of DNA-binding-1/ inhibitor of differentiation-1 (ID-1); glioblastoma; radiosensitivity; immunoblotting

通信作者:魏子龙, E-mail: weizilong2007@163.com

基金项目:上海市浦东新区卫生和计划生育委员会科技发展专项基金(PW2013A-19)

收稿日期:2014-12-23

中图分类号:R 730.26

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)09-062-03

DOI:10.7619/jcmp.201509018