Fibulin-5在盆腔器官脱垂患者主韧带组织中的表达及意义**



Fibulin-5在盆腔器官脱垂患者主韧带组织中的表达及意义**

程晓燕吴红莲吕伟超朱卫中郑红枫

浙江省丽水市人民医院妇科323000

盆腔脏器脱垂是妇科的常见病，多发于中老年妇女，虽然其对患者的生命无威胁，但是严重影响其生活质量。盆腔脏器脱垂的主要治疗方法为手术治疗，是绝经后妇女行妇科手术的常见原因[1]。但该类手术复发率较高，近30%患者因术后复发需再行手术。关于盆腔脏器脱垂的相关研究几十年，至今其发病机制尚不完全清楚，考虑为多因素的作用。其中盆底支持组织中结缔组织与其密切相关，结缔组织的弹性、韧性以及相关功能均影响着盆腔脏器脱垂的发生。弹性纤维的缺失促进了结缔组织的老化。弹性蛋白是构成细胞外基质的主要成分，一般是以弹性蛋白原的形式分泌至细胞外，通过彼此交联进而形成弹性纤维[2]。在弹性蛋白聚合过程中, Fibulin-5作为弹性蛋白交联排列的支架使LOXL-1集中在纤维集合位点从而生成弹性蛋白共价交联。本文通过测定盆腔器官脱垂患者主韧带组织中Fibulin-5的表达情况，探讨Fibulin-5与其发生发展的相关性，具体如下。

1临床资料

选择2012年12月-2014年12月我院绝经后因盆腔器官脱垂需行全子宫切除患者50例为实验组，选择同期绝经后无盆腔器官脱垂因其他妇科疾病(如子宫良性肿瘤或子宫颈上皮内瘤变等妇科疾病)需行全子宫切除患者50例为对照组。分别于术中取子宫主韧带长度约0.5cm。

2研究方法

2.1实时定量RT-PCR检测Fibulin-5 mRNA

2.1.1标本准备：所有组织均在行全子宫切除术中留取,取距宫颈0.5cm处子宫骶韧带,长度约0.5cm,离体30min内无菌条件下立即至于-80℃冰箱或液氮中保存备用。

2.1.2总RNA提取和逆转录：取上述备用主韧带组织，研磨成浆状，加入1ml Trizol匀浆，于室温下放置5min。将浆状组织移至EP管中，加入氯仿并离心，将EP管中上层水相移至新的EP管中。后加入0.5ml异丙醇，室温沉淀离心,弃上清。加乙醇1ml洗涤RNA。所得RNA溶于DEPC水中,取5μl经2%琼脂糖凝胶电泳确定RNA的完整性。其余RNA于-20℃保存。

25μl反转录体系中包括总RNA 4μg(约2μl),M-MLV(美国Promega公司) 1μl,5X缓冲液5μl,dNTP 2μl,RNasin 0.5μl,随机引物1μl,25mmol/L MgCl24μl及DEPC水。反转录条件:42℃ 60min,95℃ 5min,冰浴5min,此反应产物即为反转录的cDNA,置-20℃保存。

2.1.3实时定量PCR检测Fibulin-5 mRNA水平：采用RT-PCR法检测Fibulin-5的表达。采用逆转录酶和通用引物oligo(dT)15，以RNA为模板经逆转录反应合成cDNA第一链。再以cDNA为模板，用内标引物与目标引物进行特异的PCR扩增。PCR反应条件为：50℃ 180s、95℃ 300s，然后95℃15s、60℃ 45s，共40个循环。计算HEC1的表达量=2-ΔCt×100%，ΔCt= Ct目标基因值-CtGAPDH[3]。引物序列见表1。

表1　基因的引物和探针序列

2.2ELISA检测Fibulin-5的表达取上述备用主韧带组织，研磨成浆状，于室温下放置5min,将浆状组织移至EP管中离心，去上清液备用。采用酶联免疫吸附双抗体夹心法检测所有受检者Fibulin-5水平，试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司，按照Fibulin-5试剂盒说明书中操作流程进行操作。

2.3统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行处理，计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验及单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1两组子宫主韧带中Fibulin-5 mRNA表达水平比较经过统计学分析，结果显示观察组患者的主韧带组织中Fibulin-5 mRNA的表达为0.36±0.12，对照组为0.92±0.34，观察组Fibulin-5的表达明显低于对照组，差异显著(P<0.05)。

3.2两组患者Fibulin-5蛋白表达水平比较Fibulin-5蛋白表达在两组之间的变化与Fibulin-5 mRNA的变化趋势较为一致,观察组患者血清Fibulin-5水平为(44.8±12.0)μg/L，对照组为(110.2±40.2)μg/L，观察组Fibulin-5水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

4讨论

4.1盆腔器官脱垂的发病机制盆底功能障碍性疾病是绝经后妇女的常见病、多发病，主要病理改变为组织结构和功能的缺陷，严重影响患者的生活质量。关于盆腔脏器的研究诸多，多认为其致病是多因素作用于盆腔脏器结缔组织，导致结缔组织发生质和量上的改变，从而不能发挥支持的作用，引起盆腔脏器脱垂。早在1990年就有学者提出了“盆底整体”的理论，将盆底的结缔组织针对性地分为上中下三个水平：上段为主骸韧带复合体；中段主要是阴道的侧方支持，盆腔筋膜键弓及阴道直肠筋膜；下段为阴道的远端支持，包括会阴体和会阴隔膜。此三个水平结缔组织的任何一方发生结构改变及功能障碍，都可能导致盆腔器官脱垂的发生[3]。

细胞外基质主要包括胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖以及糖蛋白，是盆底支持组织的重要组成部分之一。任何一种成分的结构或含量的变化，都可能降低盆底组织弹性，降低其抗张能力，削弱细胞外基质对盆底的支持作用，进而引起盆腔脏器脱垂。细胞外基质的多种成分中，弹性蛋白是重要成分之一，其主要由弹性软骨细胞、平滑肌细胞以及成纤维细胞分泌。弹性蛋白是以弹性蛋白原的形式被分泌，在细胞外靠近质膜处发生交联，形成疏松的富于弹性的网状结构，即弹性纤维。弹性蛋白需要交联形成弹性纤维后，才能发挥其相应的功能[4]。弹性蛋白构成弹性纤维的中心，在蛋白外围由微纤维原包绕，可以调节弹性蛋白分子组装成弹性纤维。弹性纤维大量存在于女性生殖器官，一般状态下其代谢缓慢，而在妊娠期以及分娩后会大量重塑。一旦妊娠期或分娩时，生殖道组织弹性纤维降解之后不能很好重塑，就易破坏弹性纤维的结构，不能发挥支持的作用，引起生殖道组织结构功能的缺陷。弹性纤维的良好功能，在产后盆腔脏器的复旧中意义重大。

4.2Fibulin-5的结构与特性Fibulin家族是一个细胞外基质蛋白家族，有证据表明，Fibulins家族是蛋白质中的一个古老家族。早在原虫时期，就存在Fibulin家族，直到人类物种的形成，Fibulin家族一直高度保守。Fibulin家族主要包括两个亚群，第一个亚群主要有Fibulin-1、Fibulin-2以及Fibulin-6，第二个亚群主要有Fibulin-3、Fibulin-4、Fibulin-5以及Fibulin-7，其中第二个亚群因蛋白链较短，又称短小Fibulin。

Fibulin-5是细胞外基质的糖蛋白，共有448个氨基酸，位于14q32，在机体富含弹性蛋白的组织中广泛分布[5]。Fibulin-5的C末端含有6个cb EGF-like区域，在细胞外与钙离子结合，介导内皮细胞吸附，并结合细胞表面的整合素等，进而与原弹性蛋白结合，将原弹性蛋白整合到细胞表面，促进弹性纤维的形成。Fibulin-5促使原弹性蛋白附着并定向排列于细胞表面，通过类赖氨酞氧化酶-1 (LOXL-1)的催化，氧化脱氨基作用使得弹性蛋白中赖氨酸或轻赖氨酸氧化成醛基赖氨酸，而后合成高度稳定的共价交联结构，促进弹性纤维的组装。因此，在弹性蛋白聚合过程中，Fibulin-5作为弹性蛋白交联排列支架使LOXL-1集中在纤维集合位点从而生成弹性蛋白共价交联。正是因为弹性蛋白中富含此种交联，各个原弹性蛋白分子间的相对位置较为稳固，给予外力时虽可暂时移位，一旦去除外力，即回复到原来构型，成为弹性纤维富于弹性的结构基础[6]。

4.3Fibulin-5与盆腔器官脱垂的相关性盆腔脏器的支持主要依靠盆底结缔组织，其中弹性纤维发挥重要作用。弹性纤维在女性生殖器官中含量丰富，具有较强的膨胀及伸展能力。一般情况下，妊娠三个月的胎儿即产生弹性纤维。有学者研究小鼠真皮时发现，小鼠出生时高表达Fibulin-5、弹性蛋白原等，随后逐渐减少至一个较少的水平。在成人组织中正常生理条件下，弹性纤维的代谢较缓慢，在整个生命周期都是比较稳定地存在[7]。正常绝经后妇女的子宫主韧带组织中弹性纤维是完整没有损伤的，而盆腔器官脱垂患者的弹性蛋白受损甚至缺失，考虑盆腔器官脱垂患者在产后弹性蛋白合成减少，进而削弱了盆底结缔组织的弹性机能，进而促进了盆腔器官脱垂的发生[4]。有研究Fibulin-5基因缺失的小鼠全身的弹性纤维均严重异常，部分小鼠能成活到成年，但其大动脉缺乏顺应性，且皮肤松弛并患有严重肺气肿，进一步研究断裂的弹性蛋白片段，提示弹性蛋白酶活性未发生改变即弹性纤维分解未增加，而是弹性纤维合成缺陷。Fibulin-5是弹性纤维组装过程中的重要结合蛋白，能促进原弹性蛋白的交联，进而形成弹性纤维[8]。上文中所说的Fibulin-5基因缺失的小鼠有类似于盆腔脏器脱垂的表现，即说明在盆腔支持组织功能中弹性纤维的合成与组装是关键。弹性纤维动态平衡的破坏，可能直接导致盆腔脏器脱垂的发生。

本文通过比较盆腔器官脱垂患者与无盆底功能障碍性疾病的患者主韧带组织中的Fibulin-5的表达，发现在盆腔器官脱垂患者主韧带组织中Fibulin-5的表达量明显降低，进一步证实了Fibulin-5表达的降低可导致弹性蛋白合成障碍，无法形成稳定的弹性纤维或弹性纤维合成减少,盆底支持组织中细胞外基质弹性能力下降，导致盆腔器官脱垂的发生，说明Fibulin-5与盆腔脏器脱垂发病的相关性。

参考文献

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[3]曹霁雯.ELASTIN变异与盆腔器官脱垂〔D〕.石家庄：河北医科大学,2010.

[4]张晶,黄向华,张琳, 等.盆腔器官脱垂患者盆底结缔组织中Fibulin-5和LOXL1的表达及意义〔J〕.实用妇产科杂志,2013,29(6):437-440.

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[7]邓秀英，叶明，范雪梅,等.女性盆底障碍性疾病盆底支持组织中基质金属蛋白酶活性分析〔J〕.广州医药,2007，38(3):1-3.

[8]李博，张清富，林雪燕，等.盆腔器官脱垂患者阴道前壁组织中弹性蛋白和细胞外基质蛋白 Fibulin-5 的表达及意义〔J〕.中华妇产科杂志，2009,44(7):514-517.

(编辑雅文)

摘要目的：研究Fibulin-5在盆腔器官脱垂患者主韧带组织中的表达，分析其与盆腔器官脱垂程度之间的相关性。方法：选取我院妇科行子宫全切术的患者100例作为研究对象，根据手术病因不同分为观察组和对照组，其中观察组患者病因为盆腔器官脱垂，对照组病因为无盆底功能障碍性疾病的妇科疾病，收集所选患者的主韧带组织，采用实时定量PCR以及酶联免疫吸附法测定Fibulin-5的表达，比较两组患者Fibulin-5的表达情况并分析。结果：经过统计学分析，显示观察组患者的主韧带组织中Fibulin-5 mRNA的表达明显低于对照组，血清Fibulin-5水平亦明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：患者主韧带组织中Fibulin-5表达的降低，可导致弹性蛋白合成障碍，无法形成稳定的弹性纤维或弹性纤维合成减少,盆底支持组织中细胞外基质弹性能力下降，与盆腔脏器脱垂发病有关。

关键词Fibulin-5盆腔器官脱垂主韧带组织

Expression of Fibulin-5 in Main Ligament of Pelvic Organ Prolapse

CHENG Xiaoyan,WU Honglian,LV Weichao,etal.LishuiPeople’sHospital,ZhejiangProvince323000

ABSTRACTObjective:To study the Fibulin-5 main ligament tissue of the patients with pelvic organ prolapse, analysis with the relationship between the degree of pelvic organ prolapse.Methods:Select our hospital department of gynaecology line of 100 patients with uterine full cut method as the research object,according to different operation causes are divided into observation group and control group,the observation group of patients disease because of pelvic organ prolapse, control group disease because of non pelvic floor functional disorder disease of department of gynaecology,collect the selected patients with main ligament tissue,using real-time quantitative PCR and enzyme linked immunosorbent assay Fibulin-5 expression, compared two groups of patients Fibulin-5 expression and analysis.Results:The results of after statistical analysis,according to observation group of patients with primary Fibulin-5 mRNA expression in ligament tissue significantly lower than the control group, the serum levels of Fibulin-5 is significantly lower than the control group, there were significant difference of statistically significant (P<0.05).Conclusion:The patients with primary Fibulin-5 expression in the tissues of the ligament is reduced,which can lead to elastic protein synthesis disorder, unable to form stable elastic fiber or synthetic elastic fibers decrease,flexibility of extracellular matrix in the supportive tissue of the pelvic floor ability to drop, associated with the onset of pelvic organ prolapse.

KEY WORDSFibulin-5,Pelvic organ prolapse,The main ligament tissue

收稿日期2015-06-19

中图分类号：R711.2

文献标识码：A

文章编号：1001-7585(2015)21-2898-03

基金项目：2012年浙江省丽水市科技局课题(2012ZC040)