S100A4和HIF-1α与卵巢浆液性囊腺癌预后的关系研究

赵云红　赵　敏　张　强　郝　芳

云南省肿瘤医院昆明医科大学第三附属医院　650106

论著

S100A4和HIF-1α与卵巢浆液性囊腺癌预后的关系研究

赵云红赵敏张强郝芳

云南省肿瘤医院昆明医科大学第三附属医院650106

卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，由于起病隐匿，缺乏早期特异性症状和早期有效的诊断筛查方法，85%病例在晚期才得以诊断，而5年生存率仅15%[1]，目前标准的治疗方案是肿瘤细胞减灭术以及以铂类为基础联合化疗，然而70%的晚期患者最终将复发转移，耐药是导致其化疗失败的主要原因。S100A4是钙离子结合蛋白，通过钙离子信号转导调节细胞周期调控、细胞黏附和运动、细胞增殖分化、基因表达、酶的激活及细胞凋亡[2]。目前研究证实S100A4 可在多种恶性肿瘤中高表达，且与浸润转移及预后密切相关。HIF-1α是介导哺乳动物和人类细胞缺氧反应的核转录因子[3]，在低氧环境下HIF-1α可以激活产生多种靶基因产物，促进肿瘤血管生成、能量代谢、肿瘤侵袭和转移、肿瘤生存和增殖、放化疗耐受性、免疫逃逸等[4]；本研究检测卵巢浆液性囊腺癌中S100A4与HIF-1α的表达情况，旨在进一步探讨S100A4和HIF-1α与卵巢浆液性囊腺癌铂类化疗耐药和生存期的关系。

1资料与方法

1.1一般资料收集2007-2010年期间在我院首次手术并确诊的卵巢浆液性囊腺癌初治患者50例，同时收集卵巢浆液性囊腺瘤28例和正常卵巢组织15例(因子宫肌瘤行子宫、双附件/单侧附件切除术患者)作为对照。所有卵巢浆液性囊腺癌病例术后均予铂类为基础的多药联合化疗，主要化疗方案为PC和TC方案，给药途径为静脉化疗和腹腔化疗，疗程为4～10个不等。参照2010年版NCCN卵巢癌临床实践指南对铂类耐药和铂类敏感的定义，50例患者中28例为铂耐药患者(22/28,78.6%)，22例为铂敏感患者(10/22,45.5%)。50例卵巢浆液性囊腺癌患者均以电话或来院复查方式进行随访，随访截止时间为2014年4月。试剂：(1)S100A4浓缩型兔抗人单克隆抗体购于美国Epitomics公司。(2)HIF-1α浓缩型鼠抗人单克隆抗体购于Merck Millipore公司。PBS缓冲液、抗原修复液、DAB显色剂购于福建迈新生物技术开发有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学法。所有组织标本均经甲醛固定，石蜡包埋，制备4μm厚切片，恒温箱60℃内烤片过夜，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3%H2O2溶液室温下孵育10min，微波抗原修复15min，正常山羊血清封闭30min、一抗(工作浓度S100A4 1∶1 000；HIF-1α 1∶100) 4℃孵育过夜, 37℃复温45min后加即用型二抗工作液，室温下孵育15min，DAB显色、自来水冲洗，苏木素复染1~1.5min，0.1%盐酸酒精分化，PBS返蓝10~15min。常规脱水透明，中性树胶封片。S100A4用已知扁桃体S100A4阳性标本作为阳性对照；HIF-1α用已知乳腺癌HIF-1α阳性标本作为阳性对照，用PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.2.2评分方法。采用综合计分法[5]，无色为0分，着色弱但明显强于阴性对照者为1分，染色清晰者为2分，强染色为3分。阳性细胞率即阳性细胞占计数细胞的比例，以随机计数10个高倍视野细胞为准：阳性细胞<5%为0分，5%~25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为3分，>75%为4分。两项乘积1~2分为阴性，3分及以上为阳性，无论染色强度如何，细胞阳性率<10%为阴性。

2结果

2.1S100A4和HIF-1α蛋白的表达S100A4在卵巢浆液性囊腺癌组织和部分卵巢浆液性囊腺瘤组织中呈胞核和/或胞浆着浅黄色至棕黄色颗粒表达；HIF-1α在卵巢浆液性囊腺癌组织中呈胞核和/或胞浆着浅黄色至棕黄色颗粒表达，见图1、2和表1。

图1　S100A4蛋白阳性表达(×400)

图2　HIF-1α蛋白阳性表达(×400)

组别nS100A4蛋白表达阳性阴性阳性表达率(%)HIF-1α蛋白表达阳性阴性阳性表达率(%)卵巢浆液性囊腺癌5041982.0△▲321864△▲卵巢浆液性囊腺瘤2832510.7#0280 正常卵巢1501500150

注：良性与正常组比较,#P>0.05；恶性与正常组比较,△P<0.001；恶性与良性组比较,▲P<0.001。

2.2S100A4和HIF-1α蛋白表达的相关性卵巢浆液性囊腺癌中的S100A4蛋白表达与HIF-1α蛋白表达进行配对卡方检验(χ2=8.315，P=0.004)(见表2)，两种蛋白表达存在关联性。进一步Spearman相关性分析(r=0.408，P=0.003)，说明两种蛋白表达存在显著正相关性。

表2　S100A4蛋白表达与HIF-1α蛋白表达的相关性分析

2.3S100A4和HIF-1α与卵巢浆液性囊腺癌铂化疗耐药和生存时间的关系铂类化疗耐药组中S100A4阳性表达率为89.29%(25/28)，与敏感组(72.73%，16/22)，差异无明显统计学意义(P>0.05)；铂类化疗耐药组中HIF-1α阳性表达率为78.57%(22/28)，与敏感组(45.45%，10/22)，差异有统计学意义(P<0.05)。S100A4与HIF-1α联合表达在铂化疗耐药中P<0.005,差异有统计学意义(见表3)。

2.4S100A4蛋白与HIF-1α蛋白的表达与患者生存期的关系S100A4蛋白和HIF-1α蛋白阳性表达患者的生存时间较阴性者明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3、4。

图3S100A4蛋白表达与生存时间的关系

图4　HIF-1α蛋白表达与生存时间的关系

3讨论

S100A4是钙离子结合蛋白S100家族的24个成员之一[2]，分子量为 11.5KD，由101个氨基酸组成的多肽。编码基因定位于1q21，该区稳定性差，易发生各种染色体的缺失、易位、重叠等改变。近年研究发现，S100A4蛋白参与了细胞异常增生、细胞恶变、瘤细胞的运动性增强、细胞间黏附力降低、浸润力增强、促新生血管生长等过程，与恶性肿瘤的侵袭和转移有着密不可分的联系[6]。 S100A4 可在多种恶性肿瘤中高表达。本研究中，S100A4蛋白在卵巢浆液性囊腺瘤组织标本中低表达，正常卵巢组织标本中无表达，而在卵巢浆液性囊腺癌组织中呈高表达，提示S100A4 蛋白可能参与了卵巢浆液性囊腺癌发生发展过程。Chen等[7]siRNA沉默S100A4基因在食管鳞癌细胞中的表达，发现癌细胞侵袭转移能力明显降低。Mencia等[8]研究证实，S100A4在甲氨蝶呤耐药细胞系中高表达，与结肠癌甲氨蝶呤化疗敏感度相关。本研究发现铂类化疗耐药患者中S100A4阳性表达率与敏感患者的阳性率差异无统计学意义，但联合HIF-1α表达后与患者的化疗耐药显著相关，这可能与本研究病例偏少有关，有待扩大病例进一步研究。同时， S100A4低表达的患者生存期较高表达者明显延长，差异具有统计学意义。

缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是介导哺乳动物和人类细胞缺氧反应的核转录因子[9]由α和β亚单位组成， HIF-1α是缺氧调节的功能亚单位[10]。肿瘤细胞的无限增殖常常使肿瘤处于缺氧状态，低氧是恶性肿瘤存在的一个重要的微环境。近年研究发现HIF-1α参与了促进多种肿瘤生长[11]、血管生成和侵袭转移的过程[12]。本研究结果显示，HIF-1α在卵巢浆液性囊腺癌组织标本中高表达，与正常卵巢组织和卵巢浆液性囊腺瘤组差异有统计学意义(P<0.001)。聂春莲等[13]研究发现，下调 HIF-1α的表达，结果癌细胞对化疗药物敏感性显著增高。本研究发现化疗耐药者HIF-1α的表达明显高于敏感者(P<0.05)，低表达HIF-1α的患者生存期较高表达者明显延长，差异具有统计学意义。

Horiuchi等[14]研究发现缺氧能够诱导S100A4的表达， S100A4被siRNA抑制后，缺氧条件下，S100A4表达增加，并且侵袭力也增加。S100A4和HIF-1α之间可能存在着某种相互作用的机制，本研究发现，S100A4和HIF-1α的表达不仅呈明显正相关(r=0.408，P=0.003)，并且两因子的联合表达与卵巢浆液性囊腺癌患者的铂化疗耐药有关(P<0.05)。提示S100A4与HIF-1α高表达可能是卵巢浆液性囊腺癌发生和进展过程中的重要分子事件，可能是影响卵巢浆液性囊腺癌的铂化疗耐药重要因素。

综上所述，S100A4和HIF-1α有望作为一个分子指标，对预测肿瘤铂化疗药物敏感度和判断预后具有一定的临床指导价值。

参考文献

[1]Jemal A，Siegel R，Xu J，etal.Cancer statistics，2010〔J〕.CA Cancer J Clin，2010，60(5)：277-300.

[2]Donato R,Cannon BR,Sorci G,etal.Functions of s100 proteins〔J〕.Curr Mol Med,2013,13(1):24-57.

[3]Semenza GL,Wang GL.A nuclear factor induced by hypoxia via denovo protein synthesis binds to the human gene enhancer at a site repaired for transcriptional activation〔J〕.Mol Cell Bio,2002,12(12):5447-5454．

[4]Samoǐlenko AA．The role of hypoxia-inducible factor family(HIF) proteins in the regulation of cells physiologic responses to hypoxia 〔J〕．Ukr Biokhim Zh，2010，82(4):5-17．

[5]Fromowitz FB, Viola MV，etal.Ras P21 expression in the Progression of breast cancer〔J〕.Hum Pathol,1987,18(l):1268.

[6]Yao R, Davidson DD, Lopez-Beltran A,etal.The S100 proteins for screening and prognostic grading of bladder cancer 〔J〕. Histol Histopathol, 2007,22(9):1025-1032.

[7]Chen D, Zheng XF, Yang ZY,etal.S100A4 silencing blocks invasive ability of esophageal squamous cell carcinoma cells〔J〕. World J Gastroenterol，2012,18(9):915-922.

[8]Mencia N,Selga E,Rico I,etal.Overexpression of S100A4 in human cancer cell lines resistant to methotrexate〔J〕．BMC Cancer,2010,10:250

[9]Semenza GL,Wang GL.A nuclear factor induced by hypoxia via denovo protein synthesis binds to the human gene enhancer at a site repaired for transcriptional activation〔J〕.Mol Cell Bio,2002,12(12):5447-5454．

[10]Schumacker PT.Hypoxia-inducible factor-1(HIF-1)〔J〕.Crit Care Med,2005,33(12 Sl):423-425.

[11]Kuphal S, Winklmeier A, Watnecke C,etal.Constitutive HIF-1 activity in malignant melanoma〔J〕. Eur J Cancer,2010,46(6):1159-1169.

[12]Semenza GL.Defining the Role of Hypoxia-inducible factor 1 in cancer biology and therapeutics〔J〕. Oncol Gene,2010,29(5):625-634.

[13]聂春莲, 高国兰. 低氧诱导因子-1αRNAi 表达质粒对卵巢癌细胞影响的实验研究〔J〕.中国肿瘤临床, 2011, 28(9):485-487.

[14]Horiuchi A,Hayashi T,Kikuchi N,etal.Hypoxia upregulates ovarian cancer invasiveness via the binding of HIF-1alpha to a hypoxia-induced, methylation-free hypoxia response element of S100A4 gene〔J〕.Int J Cancer,2012,131(8):1755-1767.

(编辑落落)

摘要目的：探讨S100A4和HIF-1α与卵巢浆液性囊腺癌预后的关系。方法：收集50例卵巢浆液性囊腺癌，28例卵巢浆液性囊腺瘤和15例正常卵巢组织为对照，采用免疫组织化学法检测S100A4和HIF-1α的表达，并分析与患者预后的关系。结果：S100A4和HIF-1α在卵巢浆液性囊腺癌组织中高表达，而在卵巢浆液性囊腺瘤组和正常卵巢组中低表达或不表达。S100A4与HIF-1α表达呈显著正相关性。S100A4与铂化疗耐药无统计学意义(P>0.05)，HIF-1α与铂化疗耐药有密切关系(P<0.05)。 S100A4和HIF-1α同时表达与铂化疗耐药密切相关(P<0.05)；同时S100A4和HIF-1α阳性表达患者的生存时间较阴性者明显减少(P<0.05)。结论：S100A4和HIF-1α的表达促进卵巢浆液性囊腺癌的发生发展，并且与患者铂化疗耐药和生存时间相关。

关键词卵巢浆液性囊腺癌S100A4HIF-1α免疫组化

Expression and Clinical Significance of S100A4 and HIF-1α Protein in Ovarian Serous Cystadenocarcinoma

ZHAO Yunhong, ZHAO Ming,ZHANG Qiang，etal.TheThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,KunmingCity,YunnanProvince650106

ABSTRACTObjective:To study the expression of S100A4 and HIF-1α protein in Ovarian Serous Cystadenocarcinoma，analyzed the relationship between the two proteins.Methods:Immunohistochemistry method was used to detect S100A4 and HIF-1α proteins expression and analysis the correlation of proteins expression in Ovarian Serous Cystadenocarcinoma.Results:S100A4 and HIF-1α in Ovarian Serous Cystadenocarcinoma showed a high expression. S100A4 protein expression in Ovarian Serous carcinoma was positive relation with HIF-1α protein expression.The expression of S100A4 and HIF-1α protein existed intimate relation with cisplatin-based chemotherapy resistance (P<0.05).They are associated with overall survival,longer the overall survival,lower the expression (P<0.05).Conclusion:Expression of S100A4 and HIF-1α existed significant positive correlation.High S100A4 and HIF-1α expression predicts cisplatin-based chemotherapy resistance and the overall survival in Ovarian Serous Cystadenocarcinoma.

KEY WORDSOvarian Serous Cystadenocarcinoma，S100A4 and HIF-1α，Immunohistochemistry, Chemotherapy resistance

收稿日期2014-10-11

中图分类号：R737.31

文献标识码：A

文章编号：1001-7585(2015)01-0015-04