貂圆环病毒感染的分子流行病学研究

王玉莹，刘 晔，连 海，李 楠，张乐萃，扈荣良

（1.青岛农业大学动物科学技术学院，山东 青岛 266109；2.军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林 长春 130122）

貂圆环病毒（Minkcircovirus，MiCV）是我国最近发现的一种引起传染性水貂肠炎的新病原，临床感染以红白痢为主要特征，俗称“顽固性肠炎”。貂圆环病毒性肠炎最早于20世纪70年代末在大连地区流行，目前国内多地的养貂场均发现类似病例，在年轻貂群的感染率高达70%～80%。虽然该病致死率较低（7%～8%），但严重影响毛皮质量，而且尚无疫苗和特效药物[1]。因此，本研究在2013年9月至2014年9月，先后从山东诸城、河北饶阳和辽宁大连收集患肠炎水貂样品，通过PCR检测，对貂圆环病毒的感染情况和病毒核酸序列进行了分析，明确该病在我国的流行情况和病毒演化特征，为尽快研制针对性强的防治药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集 从2013年9月到2014年9月，在山东诸城、辽宁大连、河北饶阳3个地区主要的规模化养殖场收集病貂样品185份（主要包括水貂尸体65份和肛拭子120份）（表2）。

1.2 主要试剂和仪器 体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒（批号：04114kc5），质粒DNA小量提取试剂盒（批号：04314KA1），DNA凝胶回收试剂盒（批号：KE10120701-G），均购自康宁生命科学（吴江）有限公司。预染型PCR预混反应液（批号：A140A），pMD18-T（批号：K6701AB），均购自宝生物工程（大连）有限公司。

TGRANDIENTPCR仪，购自HYBAID公司。DYFⅢ2型电泳仪，购自Bio-Rad公司。UVI firereader XS凝胶成像系统，购自广州市华奥行仪器有限公司。1.3 检测方法 应用本实验室建立的水貂圆环病毒PCR检测方法，引物序列为F：5′-ATGCCCG⁃TAAGATCGCGAT-3′；R：5′-GGTACCTTAAGTTT⁃GCTTTGGG-3′，能够扩增貂圆环病毒Cap全基因，对采集自我国山东、河北和辽宁3个地区规模化养殖场水貂样品进行检测。根据设计引物，可以获得阳性样品水貂圆环病毒基因Cap序列，貂圆环Cap全基因序列大小为684 bp。

1.4 克隆测序与序列分析 按照1.3的方法，于山东、河北、辽宁每个地区阳性病料进行检测，选取一份阳性PCR产物进行回收，与pMD18-T克隆载体16℃连接过夜后转化DH5α感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性的细菌培养皿上37℃培养12 h后挑去单个菌落，37℃、200 r/min振荡过夜，取2mL菌液按方法1.3进行PCR鉴定，挑选阳性重组质粒送吉林省库美生物科技有限公司进行测序，序列分析用DNAMAN软件。

1.5 系统演化分析 将本实验所获得的3株毒株序列与GenBank中现有的圆环病毒属成员序列，应用MEGA4[2]进行系统演化分析。基因序列信息来源见表1。

2 结果

2.1 病料的PCR扩增 所获得的185份病貂样品，山东地区阳性率为44.4%，河北地区阳性率为63.2%，辽宁地区阳性率为54.0%，总阳性率为54.6%（表2）。根据不同季节采集样品结果显示，2014年5月份采集自辽宁大连的4份肛拭子粪便样品检测全部为阴性；2014年6月份采集自山东诸城的5份肛拭子粪便样品全部为阴性；2014年8月份采集自河北的5份肛拭子粪便样品全部为阴性。阳性样品检出率较高的时间主要集中于9～10月份，且阳性样品病貂均有腹泻症状。

2.2 基因序列的测定与分析 所获得的3个地区阳性样品测序结果显示，山东地区与辽宁地区扩增的Cap全基因完全相同，序列大小为684 bp，为貂圆环病毒Cap全基因；河北地区阳性结果与其他地区貂圆环病毒Cap全基因相比，只有3个碱基发生变化，但不同地区基因编码的氨基酸仍然一致（图1）。

2.3 系统演化分析 将新分离获得的两株圆环病毒Cap基因与GenBank中已经登录的不同种圆环病毒Cap基因序列进行演化分析，进化树显示，水貂圆环病毒与分离自菊头蝙蝠的圆环病毒最相近[3]，其同源性为73%（图2）。

表1 本文所用的基因序列信息

表2 2013年9到2014年9月收集样品信息及检测结果

图1 山东、河北和辽宁3地区分离株貂圆环病毒Cap全基因编码氨基酸比对结果

图2 水貂圆环病毒与其他圆环病毒系统演化分析

3 讨论

圆环病毒过去一直被列为未分类的病毒,是所有已知动物病毒中最小的[4]。近年来，研究发现，圆环病毒呈高度流行，在世界不同地理区域广泛分布。貂圆环病毒（Minkcircovirus，MiCV）是我国长春军事兽医研究人员于2013年发现的一种新的哺乳动物圆环病毒[1]。

根据调查结果，所有阳性水貂样品，水貂都伴随腹泻，根据病程表现为白痢、黄痢和红痢，继而出现黑色血便，口鼻苍白，最终死亡。根据检测结果显示，水貂圆环病毒在我国规模化养貂场的感染率为54.6%，需要引起重视。目前，没有疫苗可以预防本病，不同地区曾接种自家苗来预防此病，但容易受貂阿留申病毒[5]感染带来的不良影响。

根据序列分析结果显示，山东地区水貂圆环病毒Cap基因与大连地区完全相同，没有碱基突变，而河北地区仅有几个碱基变化，碱基的变化并没有导致氨基酸发生突变。实地调查结果证实，山东很多地区貂场都从大连进行调种，这是导致本病传播的因素，并且进一步揭示了水貂圆环病毒在我国不同地区流行一致性。系统演化分析表明，该病毒与蝙蝠圆环病毒同源性最近，与其他圆环病毒亲缘关系较远，这是新发现的哺乳动物圆环病毒之一，根据比对结果可以证明该病毒为新的种。目前对于该病毒研究还处于初级阶段，对病毒的致病机理和预防措施需要进一步研究。

同时，我们需要对全国不同地区养貂场养殖狐狸和貉子以及养殖人员也进行此种圆环病毒的检测，以对本病做更全面了解。

[1]Lian H，Liu Y，Li N，etal.Novel Circovirus from Mink,China[J].Emerging Infectious Diseases，2014，9（20）:1548-1550.

[2]Tamura K，Nei M，Kumar S.Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method[J].PNAS，2004，101：11030-11035.

[3]He B，Li Z，Yang F，etal.Virome profiling of bats from Myanmar by metagenomic analysis of tissue samples reveals more novel mammalian viruses[J].PLoSONE，2013，8：e61950.http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0061950.

[4]Hughes A L，Piontkivska H.Nucleotide sequence polymorphism in circoviruses[J].InfectGenet Evol，2008，8：130-138.

[5]Elisabeth G，Soren A，Anders C，etal.Nucleotide sequence anal⁃ysis of aleutian mink disease parvovirus shows thatmultiple virus types are present in infected mink[J].Journal of Virology，1991，65（8）：4378-4386.