遵义人群维生素D受体基因第八内含子多态性



基础医学研究

遵义人群维生素D受体基因第八内含子多态性

余晓1，吕纯莉2，吴莉莉3，韦若勋3

(1.遵义医学院 生物化学教研室，贵州 遵义563099；2.遵义医学院附属医院 检验科，贵州 遵义563099；3.遵义师范学院 生命科学学院，贵州 遵义563002)

[摘要]目的 探讨在遵义人群中维生素D受体(vitaminDrecepter，VDR)基因第八内含子多态分布情况。方法 收集119例遵义人群静脉血标本，用限制性片段长度多态性(RFLP)法检测VDR基因第八内含子多态性，分析该位点在遵义人群中的基因型频率和基因频率分布规律。结果 遵义人群VDR基因的基因型频率分别为69.75%(TT)、26.89%(Tt)和3.36%(tt)，基因频率分别为83.2%(T)和16.8%(t)。结论VDR基因第八内含子多态性在遵义人群中分布具有多态性。

[关键词]维生素D；受体基因；第八内含子；遵义人群；基因频率

我国是一个地域辽阔的多民族国家，分析不同地区和不同民族人群各基因位点的多态性有着非常重要的遗传学和医学价值[1]。有关遵义地区汉族人群维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)基因分布情况少见报道[2]。

VDR是介导1,25-(OH)2D3发挥生物效应的核内生物大分子之一，是类固醇激素/甲状腺激素受体超基因家族成员之一；在体内具有调节骨代谢和稳定骨量的作用；VDR基因全长75 kb，定位于人12号染色体(12q13)，共11个外显子[3-5]。已证实VDR基因第八内含子(3′末端)存在一个单核苷酸多态性，即Tru9酶切长度多态性(TGA→TAA)，没有改变VDR的氨基酸序列，但是可以影响转录产物mRNA3′末端区域的稳定性，从而影响增强子对靶部位的亲和力或影响与维生素D的亲和力，改变翻译效率从而改变VDR表达。已有研究表明该酶切长度多态性与I型糖尿病、群体骨密度、腰椎间盘退变有关联[6-8]。

因此，作者对遵义人群的VDR基因第八内含子多态性进行分析，检测其基因型和基因在人群中分布频率，为下一步基因多态与复杂基因的研究奠定基础。

1对象与方法

1.1研究对象样本来源于2008年8月至2010年7月遵义医学院附属医院检验科体检样本，全部为遵义人群，共计119例，样本间无血缘关系，男103例，女16例，平均年龄(23.28±6.47)岁；所有研究对象采集静脉血2 mL，-20 ℃低温保存；均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取用天根生化科技有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒完成。

1.2.2VDR基因第八内含子扩增聚合酶链式反应扩增用上游引物：5′-GGC AAC CTG AAG GGA GAC GTA-3′(21 bp)；下游引物：5′-CTC TTT GGA CCT CAT CAC CGA C-3′(22 bp)[7]。30 μL反应体系中包括基因组DNA 1.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×Mix 15 μL。循环参数为95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，36个循环；72 ℃ 8 min。通过2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。

Tru9酶切：10 μL反应体系中包括10×buffer F 1 μL，BSA 0.1 μL，Tru9内切酶0.3 μL(3U)，PCR产物6 μL。反应条件：65 ℃，8 h。回收后，2% 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

通过测序验证酶切结果，选择扩增良好的部分PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序。

2结果

2.1PCR扩增结果扩增产物长461 bp，位于人VDR基因第八内含子内，电泳检测为扩增良好的一条带(见图1)。

1：DL1000 DNA 分子量标记，2：阴性对照，3～11：PCR产物。图1　VDR基因i8 PCR扩增电泳图

2.2VDR基因的Tru9酶切结果酶切后，TT基因型纯合子个体缺乏Tru9酶切位点，表现为461 bp一个片段；tt基因型纯合子个体存在该酶切位点，表现为361 bp和100 bp两个片段；Tt基因型杂合子有461 bp、361 bp和100 bp三个片段。因为2%琼脂糖凝胶检测时100 bp条带不可见，所以TT基因型纯合子检测到461 bp一条带，Tt基因型杂合子为461 bp和361 bp两条带，tt基因型纯合子为361 bp一条带(见图2)。

1：DL1000 DNA 分子量标记；2、3：TT纯合子；4、5：Tt杂合子；6：tt纯合子。　　图2　VDR基因第八内含子Tru9酶切电泳图

2.3VDR基因的测序结果选择部分扩增良好的PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序。VDR基因的第八内含子Tru9酶切位点为TGA→TAA点突变：反向测序结果显示Tt基因型为TCA/TTA(见图3A)；TT基因型为TCA(见图3B)；tt基因型反向测序结果为TTA(见图3C)。

A：Q24反向测序结果示杂合子(Tt)； B：Q39反向测序结果示显性纯合子(TT)；C： 3-66反向测序结果示隐性纯合子(tt)。　　图3　VDR基因第八内含子测序图

2.4VDR基因型频率和基因频率分析对遵义人群VDR基因的基因型频率和基因频率分布进行分析可见，TT、Tt和tt基因型的频率分别为69.75%、26.89%和3.36%，T和t的基因频率分别为0.832和0.168(见表1)。

表1遵义人群VDR基因多态性情况

基因型频率分布基因频率分布TTTtttTt83(69.75%)32(26.89%)4(3.36%)0.8320.168

3讨论

迄今为止关于遵义地区人群各基因位点多态性研究鲜有报道。本文选择遵义地区人群作为研究对象，探讨人群中VDR基因的多态性，为下一步寻找疾病易感基因奠定基础。

VDR基因的编码产物是维生素D受体(VDR)，是类固醇激素/甲状腺激素受体超基因家族的成员；在人体内介导1,25-(OH)2D3发挥生物效应的生物大分子，位于细胞核内，可以调节骨代谢，并稳定骨量；VDR基因全长75 kb，定位于12号染色体(12q13)，包含11个外显子。Tru9酶切位点由Ye等发现，位于VDR基因第八内含子中，在白种人群中基因型频率为TT 80.1%、Tt 18.3%、tt 1.6%，基因频率为T 0.894，t 0.106[6]；陈为坚等[7]对广东汉族人群研究发现该位点基因频率为T 0.792、t 0.208，表明汉族人t基因频率比白种人高；张丽娅等[8]研究发现北京汉族男性该位点基因频率为T 0.822、t 0.178；郑敏等[9]研究发现广西地区儿童中该位点基因频率为T 0.797、t 0.203。本文的研究结果显示该位点在遵义人群中的分布是TT 69.75%、Tt 26.89%、tt 3.36%，基因频率为T 0.832，t 0.168，与陈伟坚、张丽娅、郑敏研究结果相近但稍偏低，表明在不同地区人群基因频率有一定差异，可能与环境因素和遵义地区人群的民族起源、各民族杂居等有关，有待进一步研究。

另外，VDR基因多态可能会影响机体内免疫反应。已经证实VDR基因与多种疾病有关，如维生素D性佝偻病[10]、多发性硬化[11]等。其中Tru9酶切位点虽然位于VDR基因的第八内含子中，G→A碱基变异没有改变VDR基因蛋白序列，但该位点恰好位于转录的mRNA3′末端区域，其多态影响mRNA的表达和稳定性，影响增强子对靶部位的亲和力，改变翻译效率进而改变VDR表达[5]，如张立等[12]研究表明Tt基因型可能是中国汉族女性患侵袭性牙周炎的危险因素。因此，在本文的研究基础上，课题组拟定展开下一步该位点与骨代谢相关疾病的研究。

[参考文献]

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[2] 张志敏,肖代敏,李学英.遵义地区汉族人群维生素D受体基因外显子2多态性[J].现代医药卫生,2013,29(22):3386-3387.

[3] 余晓,肖代敏,李学英,等.遵义汉族人群降钙素受体基因多态性与强直性脊柱炎的关系[J].广东医学,2013,34(24):3732-3734.

[4] 张志敏,肖代敏,余晓,等.遵义汉族人群维生素D受体基因FokI多态性与强直性脊柱炎的关系[J].山东医药，2013，53(40):16-18.

[5] 陈为坚,叶伟,苏培强,等.汉族人维生素D受体基因TruI酶切位点多态性及其对BsmI酶切位点多态性测定的影响[J].中华医学遗传学杂志,2007,24(3):338-340.

[6] Ye W Z, Reis A, Velho G. Identification of a novelTru9Ipolymorphism in the human vitamin D receptor gene[J]. J Hum Genet,2000,45(1):56-57.

[7] 陈为坚,叶伟,丁悦,等.汉族人维生素D受体基因TruI和FokI多态性与腰椎间盘退变的关系[J].中国矫形外科杂志,2007,15(5):373-375,379.

[8] 张丽娅,白玉蓉,韩昕,等.北京地区部分汉族男性维生素D受体基因Tru9I多态性与骨密度的关系[J].北京师范大学学报：自然科学版，2010,46(4):485-488.

[9] 郑敏,罗建明.广西地区儿童维生素D受体基因BsmI和Tru9I酶切位点多态性分布[J].实用儿科临床杂志,2010,25(7):513-515.

[10] 黎洁,李霞,姚虹,等.维生素D受体基因多态性与维生素D性佝偻病的关系[J].中国综合临床,2006,22(11):1044-1045.

[11] 吴斌,卢宏,张深义,等.河南汉族人群多发性硬化与维生素D受体基因多态性相关性研究[J].山东医药,2009,49(24):86-87.

[12] 张立,孟焕新,赵红珊,等.维生素D受体基因多态性与牙周炎的关系[J].北京大学学报：医学版,2010,42(1):37-40.

[收稿2015-10-10;修回2015-11-12]

(编辑：王静)

The eighth intron of Vitamin D receptor gene polymorphism in Zunyi population

YuXiao1,LvChunli2,WuLili3,WeiRuoxun3

(1.Department of Biochemistry, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China;2. Clinical Laboratory,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China; 3. College of Life Science, Zunyi Normal College, Zunyi Guizhou 563002, China)

[Abstract]Objective To investigate the polymorphism distribution in the eighth intron of Vitamin D Receptor (VDR) gene in Zunyi.Methods Collecting 119 blood samples in Zunyi area, the eighth intron polymorphism ofVDRgene was tested by Restriction Fragment Length Polymorphism analysis, and the distribution of the genotypes and allele frequencies were analyzed.Results The frequencies of genotypes were 69.75%(TT),26.89%(Tt) and 3.36%(tt). The frequencies of theVDRgene were 83.2%(T) and 16.8%(t).Conclusion The eighth intron ofVDRgene in Zunyi population has polymorphisms.

[Key words]vitamin D;receptor gene；the eighth intron；Zunyi population;the fregnencies of gent

[中图法分类号]R681.5

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2015)06-0604-03

[通信作者]韦若勋，男，博士，副教授，研究方向：分子进化，E-mail:weiruoxun@126.com。

[基金项目]遵义师范学院基础教育研究项目(NO：13ZYJ063)。