Smad4介导Activin A 信号在PC12细胞OGD损伤中作用研究

尤如芹，王姣琦，刘洪雨，崔　杨，何金婷，纪秋野，刘永峰，莽　靖*，徐忠信*

(1.吉林大学中日联谊医院 a.神经内科;b.科学研究中心，吉林 长春130033；2.美国奥尔巴尼医学院)

Smad4介导Activin A 信号在PC12细胞OGD损伤中作用研究

尤如芹1a，王姣琦1a，刘洪雨1a，崔杨1a，何金婷1a，纪秋野1b，刘永峰2，莽靖1a*，徐忠信1a*

(1.吉林大学中日联谊医院 a.神经内科;b.科学研究中心，吉林 长春130033；2.美国奥尔巴尼医学院)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0525)

目前研究认为ActA 在中枢神经系统存在表达。缺血性脑损伤后，其分泌增加，并以靶源性方式作用于神经细胞，激活ActA/Smads信号转导通路，继而发挥神经保护功能[1,2]。基于其他系统组织或疾病背景下的研究证实Smad4可能通过从细胞质向细胞核内的迁移而介导ActA下游信号，但在缺血性脑损伤中尚未得到证实。本研究应用神经元样PC12细胞的OGD模型体外模拟脑缺血损伤，利用免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜对Smad4的质核分布进行检测，以明确Smad4在介导PC12细胞OGD损伤中ActA 信号转导的模式及作用。

1材料和方法

1.1　主要材料

大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞购自金紫晶生物医药技术有限公司。牛血清白蛋白(BSA)、鼠神经生长因子(NGF)购自美国Sigma公司。连二亚硫酸钠购自上海鼎国生物技术有限公司。Triton X-100购自上海碧云天生物技术有限公司。兔抗大鼠Smad4一抗购自美国Abcam公司，Cy3标记的羊抗兔二抗购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1PC12细胞培养及神经元样转化正常PC12细胞常规培养在含10 %胎牛血清和10 %马血清的高糖DMEM培养液中，并于37 ℃，5 % CO2培养箱中饱和湿度培养。细胞接近70 %融合时更换为含NGF(终浓度50 ng/ml)的培养液，连续刺激5天，以诱导细胞神经元样转化[3]。

1.2.2PC12细胞氧糖剥夺模型建立取生长状态良好的神经元样PC12细胞，用无糖DMEM培养液轻轻冲洗3次，而后用含10 %胎牛血清和终浓度1.0 mmol/L连二亚硫酸钠的无糖DMEM培养液于37℃孵箱内的缺氧罐中进行氧糖剥夺(Oxygen-Glucose Deprivation，OGD)处理[4]。计时0 h和3 h建立神经元样PC12细胞OGD 0 h和3 h组。

1.2.3Realtime-PCR检测ActA mRNA表达水平Premier 5.0 软件根据Genbank检索的核苷酸序列设计ActA引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：U:5′-TAG TTT ACC TGG GAT GAA GC -3′；D:5′-TAG CAC CCT CTA ACA CCT CT -3′。根据之前描述的方法于OGD不同时间点应用SYBR Green法行Real-time PCR 检测[4]。

1.2.4激光共聚焦观察Smad4的质核分布以4×104/密度将PC12细胞接种于预先放有细胞爬片的24孔细胞培养板。次日细胞贴壁后加入NGF(终浓度50 ng/ml)，连续诱导5 d。继而OGD处理0 h、3 h、6 h、12 h后挑出细胞爬片，0.3% Triton X-100处理20 min，PBS浸洗后，2 % BSA封闭30 min，而后滴加Smad4一抗(1∶500)4℃湿盒中过夜孵育。避光条件下加入Cy3标记的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h后进行DAPI(1 μg/ml)染色，37℃避光孵育15 min，梯度脱水后防淬灭封片剂封片，共聚焦显微镜554 nm下观察Smad4的质核分布情况。

2结果

2.1　PC12细胞的神经元样转化

正常PC12细胞为圆形或椭圆形，呈半悬浮状态，易聚集成团。经NGF连续诱导5 d后，细胞贴壁，停止分裂生长并伸出较长的突触，呈神经元样。

2.2　ActA mRNA 表达变化

神经元样PC12细胞OGD 3h ActA mRNA相对表达量(1.86±0.08)较0 h显著增高(P<0.05)；OGD 6h表达量(0.65±0.07)及OGD 12h(0.57±0.06)表达量逐渐下降(图1)，与OGD 3h比较，差异显著(P<0.05)。

注：*与OGD 0h组比较P<0.05，△与OGD 3h组比较P<0.05

2.3　Smad4的质核分布比较

激光共聚焦显微镜554 nm的激发光下Cy3标记的Smad4呈红色荧光，细胞核经DAPI复染后呈蓝色。融合后图像显示，OGD 3 h分布于细胞核内Smad4蛋白数量较OGD0h显著增多，OGD 6h开始逐渐下降，OGD12 h达最小值。

3讨论

近期研究发现，作为转化生长因子β(Transforming growth factor-beta，TGF-β)超家族的成员之一，ActA具有抗缺血性损伤，促进神经功能恢复的功能[2,8]。ActA作为一种细胞外的信号启动因子，其信号转导主要依靠Smad蛋白家族介导，但目前其参与脑缺血损伤与修复的信号转导机制尚未完全阐明。

课题组前期研究证实，与经典的ActA信号转导通路一致，在脑缺血损伤诱导的ActA信号激活过程中，细胞外的ActA通过与跨膜受体结合，磷酸化激活下游的Smad2/3[3]。基于其他系统组织或疾病背景下的研究证实Smad4可能通过从细胞质向细胞核内的迁移而介导ActA下游信号[5]，但在缺血性脑损伤中尚未得到证实。本研究应用神经元样PC12细胞的OGD模型体外模拟脑缺血损伤，利用免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜对Smad4的质核分布进行检测，以明确Smad4在介导PC12细胞OGD损伤中ActA 信号转导的模式及作用。结果显示：神经元样PC12细胞OGD3 h ActA mRNA相对表达量较0 h显著增高；OGD6 h表达量及OGD12 h表达量逐渐下降。OGD 3 h分布于细胞核内Smad4蛋白数量较OGD0h显著增多，OGD6 h开始逐渐下降，OGD12 h达最小值。研究结果一方面进一步证实了缺血损伤可诱导神经细胞ActA信号激活，与课题组前期的体内外研究结果相一致[4,8]；而另一方面，本研究结果也提示了在脑缺血损伤这一病理及病理生理过程中，被诱导激活的ActA信号强度呈动态变化过程，即其在缺血早期可能介导了短时程的脑保护信号。

脑组织对缺血性损伤十分敏感，脑局部血流中断5 min即会出现脑组织不可逆性损伤[6,7]，因此，本研究结果可能对为缺血性脑卒中的治疗赢得时间，从而改善脑梗死患者预后，提高生活质量具有重要意义。另外，本研究结果证实了Smad4在介导ActA信号从细胞质到细胞核转导的模式，检测方法具有一定创新性。如用传统的Western-blot蛋白检测技术，需单独提取核蛋白，工作复杂。本研究采用免疫荧光染色技术对Smad4(Cy3)及细胞核(DAPI)进行不同标记，在激光共聚焦显微镜下对Smad4的空间位移进行半定量检测，方法简便易行，提高了检测效率及准确性。

综上，本研究证实了OGD损伤可诱导神经元样PC12细胞ActA信号激活，Smad4可通过质核移位介导ActA 信号在受体水平下游的信号转导，且随时间延长呈动态变化，实验结果扩展了脑缺血损伤相关ActA信号转导机制的研究思路。但本研究为体外细胞水平实验研究，与体内真实环境尚存在一定差距，尚需在后续研究中丰富体内实验结果。

参考文献：

[1]Mang J,Mei C-L,Wang J-Q,et al.Endogenous Protection Derived from Activin A/Smads Transduction Loop Stimulated via Ischemic Injury in PC12 Cells [J].Molecules,2013,18(10):12977.

[2]Mukerji SS,Katsman EA,Wilber C,et al.Activin is a neuronal survival factor that is rapidly increased after transient cerebral ischemia and hypoxia in mice [J].Cereb Blood Flow Metab,2007,27(6):1161.

[3]Mei Chun-li,He Jin-ting,Mang Jing,et al.Nerve growth factor (NGF) combined with oxygen glucose deprivation OGD induces neural ischemia tolerance in PC12 cells [J].African Journal of Biochemistry Research,2011,5(10):315.

[4]莽靖，何金婷，王娇琦，等.脑缺血损伤ActA与跨膜受体ActRIIA在Smads转导通路中的表达[J].中风与神经疾病杂志，2013,30(1):15.

[5]Heldin CH,Miyazono K,ten Dijke P.TGF-beta signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins[J].Nature，1997，390(6659):465.

[6]Dirnagl U,Iadecola C,Moskowitz MA.Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view [J].Trends Neurosci，1999，22(9):391.

[7]Broughton BR,Reutens DC,Sobey CG.Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia [J].Stroke，2009，40(5):e331.

[8]He Jin-Ting,Mang Jing,Mei Chun-Li,et al.Neuroprotective Effects of Exogenous Activin A on Oxygen-Glucose Deprivation in PC12 Cells [J].Molecules,2011,17(1):315.

摘要：目的明确OGD损伤诱导的PC12细胞激活素A(Activin A， ActA)信号在细胞内基于Smad4的转导模式及作用。方法使用鼠神经生长因子(NGF，50 ng/ml)诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞向神经元样转化，利用无糖DMEM培养液联合连二亚硫酸钠(1 mmol/L)构建神经元氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型，体外模拟神经元缺血性损伤。OGD 0、3 h、6 h、12 h后Realtime-PCR检测ActA mRNA表达水平；激光共聚焦观察免疫荧光染色后的Smad4质核分布情况。结果NGF诱导后PC12细胞贴壁并伸出较长的突触，向神经元样转化。细胞OGD处理3 h后ActA mRNA表达水平较0 h显著升高，6 h开始下降；OGD3 h后Smad4在细胞核内的分布较OGD 0 h明显增加，6小时开始下降。结论OGD损伤可诱导神经元样PC12细胞ActA信号激活，Smad4可通过质核移位介导ActA 信号在受体水平下游的信号转导，且随时间延长呈动态变化。

关键词：脑缺血损伤；激活素A；Smad4

Effects of ActivinA signaling mediated by Smad4 in PC12 cell suffered by OGDYOURu-qin,WANGJiao-qi,LIUHong-yu,etal.(DepartmentofNeurology,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the transduction mechanisms and function of the ActivinA (ActA)signaling based on Smad4 in the oxygen-glucose deprivation (OGD) PC12 cell line.MethodsNerve growth factor (NGF,50ng/ml) was used in this study to induce the differentiation of rattus PC12 pheochromocytoma cells to nerve-like cells.Then the glucose-free DMEM and hyposulfite of Na2S2O4(1 mmol/L) was introduced to cells to construct an OGD model in vitro.The expression of ActA mRNA in OGD 0 h/3 h/6 h/12 h group was abserved by Realtime-PCR.And after immunofluorescence staining,the intranuclear mobility of Smad4 in OGD 0 h/3 h/6 h/12 h group was observed under the confocal laser scanning microscope at 554 nm.ResultsPC12 cell was successfully differentiated into nerve-like cell after NGF exposure.Compared to the group of OGD 0 h，the expression of ActA mRNA in OGD 3 h group was significantly increased，while gradually decreased in OGD 6 h and 12 h group.The fluorescence intensity of Smad4 in nuclei was increased in OGD 3 h group compared to that in OGD 0 h group,and decreased in OGD 6h group.ConclusionOGD injury could activate the ActA signaling in nerve-like PC12 cell line.Smad4 could mediate the tranduction of ActA signaling through cytoplasmic-nuclear translocation.

Key words:Brain ischemia;Activin A;Smad4

收稿日期：(2014-09-24)

文献标识码：A

中图分类号：R743.3

文章编号：1007-4287(2015)04-0525-04

通讯作者*

基金项目：国家自然基金面上项目(81371298)；吉林省科技发展计划国际合作项目(20120723);吉林省产业技术研究与开发项目(2013C030-4);吉林大学白求恩前沿交叉学科创新项目(2013107028);吉林大学白求恩医学青年科研基金项目(2013207052)