FXR在肝细胞癌组织和癌旁正常组织中的差异表达



FXR在肝细胞癌组织和癌旁正常组织中的差异表达

孟祥宽1,刘念1，冯虎1,陈玉丙1,王欣2*

(吉林大学第二医院 1.放疗科;2.检验科，吉林 长春130041)

肝细胞癌(HCC)占原发性肝癌的90%。每年大约有67万新发病例，在全世界恶性肿瘤中，发病率占第五位，而死亡率则排第三，严重危害人民的健康[1]。HCC的发生和发展是一个涉及多因素、多基因和多步骤的复杂过程[2]，其具体机制仍在不断探索之中。近年来，越来越多的证据显示长期高水平胆汁的刺激、脂肪肝等机体代谢失调与HCC的发生有关[3，4]。法尼酯X受体(FXR)是核受体超家族的一员，人的FXR基因定位于12号染色体(12q23.1)，主要在肝、小肠、肾及肾上腺组织中表达，调节胆汁酸代谢、胆固醇代谢、脂代谢，有维持机体代谢稳态的作用[5]。可见FXR的正常表达对抑制HCC的发生有很大意义。在动物实验中，Yang F[6]首次发现FXR基因敲除的小鼠将会自发形成HCC，随后Kim[7]的研究也证实了这一结论。但是，人HCC的形成与FXR表达的关系尚不清楚。本研究拟通过分析50例临床HCC患者癌组织及癌旁正常组织FXR表达的差异，探讨人HCC的形成与FXR表达的变化关系。为HCC的临床治疗实践制定新策略及药开发新靶点提供理论基础。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1病例来源选取2012年08月至2013年12月吉林大学第二医院肝胆外科住院接受肝切除术治疗的50例HCC患者的肝癌组织及癌旁正常组织。患者病历资料完整，均于术后经吉大二院病理科病理检查证实为肝细胞癌，所有病例术前均未行放化疗及免疫治疗。组织标本于术后立即切取，取癌旁组织(距癌组织5 cm以上)作为对照组。甲醛固定，石蜡包埋。

1.1.2试剂鼠抗人FXR单克隆抗体(Abbiotec，购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司)免疫组化染色试剂盒(即用型免疫组化 kit-9710，购自福州迈新生物技术开发有限公司)。

1.2　方法

1.2.1免疫组织化学法对癌组织和癌周正常组织FXR进行免疫组化染色。所有标本均经过甲醛固定，石蜡包埋，4um连续切片，常规HE染色，镜检。将载玻片用二甲苯脱石蜡，随后用乙醇和PBS洗涤。组织切片用EDTA缓冲液高压修复10 min，修复后的切片在缓冲液中冷却后，滴加过氧化物酶阻断溶液；用50-100 ml血清封闭，滴加一抗，4℃冰箱孵育过夜；滴加生物素标记的第二抗体，室温10 min；滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，室温10 min；DAB显色，苏木素复染2 min，盐酸酒精分化，氨水返蓝，过酒精(80% 2 min，90% 2 min，95% 2 min，100% 5 min，100% 5 min)，过二甲苯 3 min，过二甲苯 3 min；树脂封片，镜检。

1.2.2结果判定 观察肝癌和癌旁组织中阳性细胞所占比例和细胞核FXR阳性染色的强弱，并使用IMAGE PRO软件处理图像得到灰度值。

1.3统计学处理Excel表格收集数据，除6例患者癌旁组织资料缺失外，对其余44例患者的肝癌组织与癌旁正常组织FXR表达差值进行正态分布检验，如符合正态分布，采用配对t检验分析肝癌和癌旁组织中FXR表达的差异，如不符合正态分布，校正后进行配对T检验，全部统计过程通过SPSS21.0实现。

2结果

2.1临床特征分析收集的50例HCC患者的94个临床组织标本(肝癌组织50例，癌旁组织44例)的临床特征详细列于表1。可见肝癌高发年龄段为40-60岁，男性明显多于女性，可能与男性饮酒、肥胖有关。

2.2FXR在肝癌和癌旁组织中的表达所有选定的肝癌患者均经过HE染色组织病理学确诊为肝细胞癌(见图1 A，A′，B，B′)。通过免疫组织化学染色法检测，我们发现FXR在肝细胞癌组织中核FXR阳性染色较浅，呈黄色，且阳性细胞所占比例小(见图1 E，E′，F，F′)。而癌旁正常组织中核FXR阳性染色较深，呈黄褐色；且阳性细胞所占比例大(见图1C，C′，D，D′)。

表1　94例组织样本的临床特征

2.3免疫组化图像的相对灰度值分析使用IMAGE PRO软件对肝细胞癌和癌旁组织的免疫组化结果分析得到相对灰度值。将癌旁组织资料缺失的6例患者去除，将剩余的44例患者的肝癌组织与癌旁组织组成配对资料。FXR表达量的差值行正态分布分析，均值=0.09，标准偏差=0.034，中值=0.08，众数=0.07，采用Kolmogorov-Smirnov及Shapiro-wilk法检验，P值分别为0.094和0.397，符合正态分布(见图2，3)。用配对t检验分析肝癌组织与癌旁组织FXR表达量的差异，结果显示FXR在肝癌组织中的表达与癌旁组织相比显著降低(t=14.765，P<0.00001)，见表2。

图1　两例HCC患者癌组织和癌旁组织FXR的表达差异

图2　肝癌组织与癌旁组织FXR表达量差值的

图3　肝癌组织与癌旁组织FXR表达量比较

3讨论

近期研究[6,7]报道了FXR基因敲除的小鼠将会自发形成HCC，而人HCC的发生与FXR表达情况的关系目前还不太清楚。本研究选取了来自50例HCC患者的94个标本(包括肝癌组织50例及癌周正常组织44例)，通过免疫组化染色分析了FXR在癌组织及癌旁正常组织的表达情况，检测结果提示肝癌组织与癌旁正常组织相比阳性细胞所占比例小，且核FXR阳性染色较浅。使用IMAGE PRO图象分析仪得到的灰度值，通过配对t检验显示FXR在肝癌组织中的表达与癌旁组织比较显著降低(P<0)。不独有偶， Lax S[8]等研究发现人结肠癌组织与癌周组织比较 FXR 表达下降，其下降程度与肿瘤的恶性程度呈正相关。这可能与FXR下调造成的长期高水平胆汁酸的潜在致癌性有关。

表2　肝癌组织与癌旁组织FXR表达量配对t检验的结果

研究表明[9]FXR被内源性配体胆汁酸或人工合成配体激活后,与视黄醛X受体(retinoidX receptor,RXR)结合形成异二聚体,通过与靶基因中称为FXR反应元件的特定核苷酸序列结合而调节靶基因的转录。通过抑制胆汁酸合成途径中的胆固醇7-α羟化酶而控制胆固醇转变为胆汁酸，促进肝胆汁酸的排泄并减少肠肝循环中胆汁酸的回吸收，从而保护胆汁的过度负荷对肝脏造成的损害。Zhang Y[10]发现FXR还可以通过小异二聚体伴侣(SHP)促进细胞凋亡和抑制细胞增殖，活化的FXR可能不仅对非肿瘤细胞的增殖重要，还可能阻断肿瘤的生长。

FXR表达的减少可能出现在正常肝细胞逐步恶变到肝癌的过程中，由于我们没有系统地分析肝细胞变性、肝炎、肝硬化到肝癌的整个过程，我们不能确定FXR表达缺失到底发生在癌变的哪一个环节。其中的变化机制值得我们进一步的研究。

FXR参与体内代谢平衡、细胞的增殖和凋亡，甚至在HCC发展中的具有潜在作用，这一结论可能会打开HCC预防和治疗的新途径。由于正常肝组织逐渐恶变到肝癌与FXR表达降低甚至丧失有关，通过刺激FXR的信号通路来调节细胞增殖和分化可能成为一种新的治疗癌症的靶点或策略。

参考文献：

[1]Wang Z,Zhang G,Wu J,et al.Adjuvant therapy for hepatocellular carcinoma:current situation and prospect[J].Drug Discov Ther，2013，7(4):137.

[2]Wapinski O,Chang HY.Long noncoding RNAs and human disease[J].Trends Cell Biol，2011，21(6):354.

[3]Tanaka K,Tsuji I,Tamakoshi A,et al.Obesity and liver cancer risk:an evaluation based on a systematic review of epidemiologic evidence among the Japanese population[J].Jpn J Clin Oncol,2012，42(3):212.

[4]Tsuei J,Chau T,Mills D,Wan YJ.Bile acid dysregulation,gut dysbiosis,and gastrointestinal cancer[J].Exp Biol Med (Maywood)，2014，239(11):1489.

[5]Wang YD,Chen WD,Moore DD,et al.FXR:a metabolic regulator and cell protector[J].Cell Res，2008，18:1087.

[6]Yang F,Huang X,Yi T,et al.Spontaneous development of liver tumors in the absence of the bile acid receptor farnesoid X receptor[J].Cancer Res，2007，67(3):863．

[7]Kim I,Morimura K,Shah Y,et al.Spontaneous hepatocarcinogenesis in farnesoid X receptor-null mice[J].Carcinogenesis，2007，28(5):940．

[8]Lax S,Schauer G,Prein K,et al.Expression of the nuclear bile acid receptor/farnesoid X receptor is reduced in human colon carcinoma compared to nonneoplastic mucosa independent from site and may be associated with adverse prognosis[J].International journal of cancer. Int J Cancer，2012，130(10):2232.

[9]Zhang Y,Kast-Woelbern HR,Edwards PA.Natural structural variants of the nuclear receptor farnesoid X receptor affect transcriptional activation[J].J Biol Chem，2003，278(1):104.

[10]Zhang Y,Soto J,Park K,et al.Nuclear receptor SHP,a death receptor that targets mitochondria,induces apoptosis and inhibits tumor growth[J].Mol Cell Biol，2010，30:1341.

(收稿日期：2014-09-18)

文章编号：1007-4287(2015)07-1169-03

*通讯作者

基金项目：本论文研究受吉林省科技厅项目资助(项目编号为：201215072)