丹红注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤血管内皮生长因子表达的影响

李龙珠，刘家军，李贤玉，吴胜英*，郭俐宏

丹红注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤血管内皮生长因子表达的影响

李龙珠1a，刘家军1b，李贤玉2，吴胜英2*，郭俐宏3

目的 研究丹红注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法 90只大鼠中，选择12只为假手术组，另78只经右侧翼腭动脉线栓willis环阻塞60 min后再灌注60 min，反复3次，建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的动物模型。术后7 d选择其中36只造模成功大鼠，随机分为模型组、丹红A组、丹红B组。四组大鼠均采用尾静脉注射给药治疗，并于治疗前及治疗14 d后分别检测各组动物血管内皮细胞生长因子(VEGF)蛋白质及VEGF mRNA、缺氧诱导因子-1a (HIF-1a)、HIF-1a mRNA、受体胎肝激酶1(FLK-1)、FLK-1 mRNA，脑组织TTC染色并测定脑梗死范围。结果 治疗14 d后，丹红组VEGF蛋白质及VEGF mRNA、HIF-1a、HIF-1a mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA明显增高；TTC组织学检查显示，部分脑组织神经细胞溶合且排列紊乱，但脑梗死范围明显缩小。与模型组比较，各指标差异均有统计学意义(P<0.05)；丹红A组、B组各指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 丹红注射液可减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注后血管内皮炎症反应程度，其作用机制可能与其促进VEGF分泌、拮抗Ca2+内流、松弛脑血管平滑肌、增加血管通透性、促进血管内皮细胞增殖、诱导缺血部位血管新生有关。

局灶性脑缺血再灌注损伤；丹红注射液；血管内皮细胞生长因子

0 引言

急性脑梗死(Acute cerebral infarction，ACI)又称急性缺血性脑卒中，其起病急骤，病死率及致残率达50%以上，是临床常见的严重威胁人类健康的心脑血管疾病。临床表现多以局灶性脑缺血梗死所致脑血管急性血流障碍及急性脑功能缺损为主[1]。流行病学资料显示，每年新发病例200万，死亡率达30%～50%[2]。近年来，丹红注射液常用于治疗此类心脑血管疾病，临床效果可靠。目前，其对局灶性脑缺血再灌注损伤致血管内皮再生的影响及其机制鲜有报道。本研究制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，经尾静脉注射丹红注射液，系统观察丹红注射液对局灶性脑缺血再灌注损伤模型大鼠VEGF表达的影响，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠90只，鼠龄6～8周，体重(200±20) g，雌雄兼用，由湖北医药学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证编号：SCXK(鄂)2014-0008，实验动物设施使用许可证编号：SYXK(鄂)2014-0031。

1.2 药品试剂及仪器 BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟电子有限公司)。精密电子天平(上海精密电子天平医疗仪器公司，FA-1004)。丹红注射液(菏泽步长制药有限公司，国药准字：Z20026866)；VEGF、FLK-1试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，HIF-1 (北京博奥生生物技术公司)，提取mRNA试剂及反转录试剂(美国Invitrogen公司)。自制栓线(将钓鱼线剪成长约50 mm，并在18 mm处作标记，酒精消毒后置于生理盐水中备用)。

1.3 大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤动物模型制备 参照文献[3]，选择78只大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)经腹腔注射麻醉，仰卧固定，颈正中切口，分离右侧颈总动脉并找到翼腭动脉起始部置一微动脉夹，同时夹闭颈总动脉及颈内动脉主干近端。在颈外动脉剪一V型小口，将制备好的栓线插入，此时将颈外动脉残端处丝线的松结拉紧，除去颈内动脉的微动脉夹，继续将丝线沿颈内动脉插入18 mm或有阻力感为止，保持60 min后即可抽出丝线并除去微动脉夹再通60 min，反复3次。术后以左侧前肢内收、提尾悬空不能伸展左侧前爪、行走向左侧转圈为入选标准。本次动物模型制备术后有51只大鼠存活且符合局灶性脑缺血再灌注损伤动物模型入选标准，模型成功率达65% (51/78)。选择其中36只大鼠，采用随机数字表法随机均分为模型组及丹红A组、B组，另选12只为假手术组(假手术组手术同上但不插入栓线)进行对照。采用经尾静脉注射给药治疗的方法，丹红大剂量组给予丹红注射液4 mL/kg，小剂量组减半(2 mL/kg)，假手术组及模型组注射等量生理盐水，四组动物连续注射治疗14 d。

1.4 检测指标 参照文献[4]，在经尾静脉注射丹红注射液治疗前，四组大鼠各选6只断头处死，迅速分离出脑组织后放入液态氮中暂存，2 h内转移至-70 ℃低温冰箱保存以备VEGF蛋白分析。治疗14 d后，同上步骤取各组大鼠脑组织，研磨并2 000转离心，严格按SP试剂盒说明操作，采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学检测脑组织治疗前后各组脑组织标本中VEGF、VEGF mRNA、HIF-la、HIF-la mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA表达。

1.5 大鼠脑梗死范围 在治疗14 d后断头处死4组大鼠，并迅速分离脑组织后滤纸吸干称重，-20 ℃冰冻20 min，冠状面均匀切成2 mm厚脑片，并迅速放入1% TTC溶液中，37 ℃避光染色30 min，4%多聚甲醛固定，此时梗死区着色加深，剥离着色梗死部位，用精密电子天平精确称量，计算脑梗死范围，脑梗死范围(%)=梗死部位质量/脑总质量×100%。

2 结果

2.1 丹红注射液对局灶性脑缺血大鼠VEGF等指标的影响 治疗后14 d，模型组VEGF蛋白质、VEGF mRNA、HIF-1a、HIF-1a mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA的表达呈上调趋势，与假手术组比较，差异有统计学意义(F=57.37～75.86，q=8.30～121.21，P<0.05)，提示局灶性脑缺血造模成功。缺血、缺氧是促进VEGF分泌的最主要因素，此时血管内皮损伤严重。丹红A、B组VEGF蛋白质、VEGF mRNA、HIF-1a、HIF-1a mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA的表达均明显上调，与本组用药前及模型组比较，差异有统计学意义(F=52.02～72.33，q=8.97～102.54，P<0.05)，但A、B组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 丹红注射液对脑梗死范围的影响 丹红A、B组脑梗死范围分别为12.36%±1.58%、12.60%±1.67%，明显低于模型组(31.65%±2.72%)，差异有统计学意义(q=7.58～87.98，P<0.05)，A、B组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 组织学检查 见图1。脑组织TTC图片显示，假手术组脑组织神经细胞排列整齐，着色均匀，无坏死现象；模型组梗死区着色加深，脑组织神经细胞溶合排列紊乱，出现明显坏死现象；丹红A、B组TTC染色相似，梗死区着色均加深，梗死区明显减少，有部分脑组织神经细胞溶合且排列紊乱，但少于模型组。

表1 丹红注射液对局灶性脑缺血大鼠血管内皮VEGF各项指标的影响

注：与治疗前比较，*P<0.05；与假手术组比较，#P<0.05；与模型组比较，&P<0.05

图1 不同组别大鼠脑缺血梗死区病理图片

3 讨论

丹红注射液是由丹参和红花两味中药采用现代特殊工艺科学配方提取的复方注射液。丹参味辛性凉，“治心脑腹痛”(《吴普本草》)；红花味辛性温，“善通利经脉”(《药品化义》)[5]。丹红注射液具有活血化瘀通经、祛瘀止痛之功效[6]，能有效降低血液粘稠度，改善微循环，扩张血管，防治缺血再灌注损伤，进而改善心、脑供血不足，营养脑组织[7-8]，现已广泛应用于心脑血管系统、神经系统、内分泌系统等疾病的治疗[9]。

VEGF是一种高度特异性的促血管生长因子，参与动脉侧支循环形成的调节，VEGF的高低常作为血管内皮功能及侧支循环建立情况的重要指标[10]。正常情况下，氧自由基的生成与清除维持着动态平衡，血管内皮保持其完整性。在急性脑梗死时，由于脑血管急性血流障碍，脑组织局部缺血缺氧，细胞Na+-K+-ATP酶大量释放，Ca2+内流并造成钙超载，钙超载可使线粒体受到破坏而导致细胞能量代谢障碍，此时机体会产生大量的氧自由基，且机体清除氧自由基能力下降，血管内皮细胞严重受损[11]。现代医学研究发现，丹参具有拮抗Ca2+内流、改善ATP酶活性、松弛血管平滑肌改善微循环、提高组织耐缺氧的作用[12]。

本研究结果显示，治疗14 d后，丹红注射液大小剂量组VEGF、VEGF mRNA、HIF-1a、HIF-1a mRNA、FLK-1及 FLK-1 mRNA表达均有不同程度的上调，说明丹红注射液亦具有促进VEGF分泌、诱导血管再生、促进受损血管内皮修复的功能[13]。推测其原因：丹红注射液促进Ca2+-ATP酶活性恢复，增强Na+-K+-ATP酶活力，减少细胞内钙超载，并通过Na+-K+-ATP酶调节钠氢交换抑制钠钙交换，阻止Ca2+内流，改善心肌组织能量代谢[14]，起到活血化瘀、改善微循环、增加脑组织供氧的作用。急性缺血性脑卒中的临床症状和预后有赖于动脉侧支循环重建，因此，积极寻找具有促进缺血血管新生的临床常用药物对缺血性疾病的治疗具有重大意义。侧支循环的形成和开放能够减轻心脑组织缺血缺氧，防止脑组织细胞坏死而改善临床症状。VEGF是血管内皮细胞特异性促有丝分裂原[15]，可促进心脑等缺血组织的血管生成，促进侧支循环血管重塑并建立有效的侧支循环[16]。

本研究证实丹红注射液具有增加血管内皮VEGF分泌的作用，对血管内皮细胞可能具有趋化反应，诱导血管内皮细胞增殖，参与维持成熟血管的完整性，促进脑血管损伤后血管再生内皮化，进而促使脑血管重塑的作用。但缺血再灌注损伤机制是一个多因素参与的复杂的病理改变过程，丹红注射液如何在各个环节发挥调节和干预作用并阻断其发生，还有待于深入研究。

综上所述，丹红注射液能够增加缺血脑组织VEGF的表达，缩小脑梗死范围，促进缺血部位新生血管的生成，对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用。

[1] Felberg RA,Burgin WS,Grotta JC,et al.Neuroprotection and the is Chemic cascade[J].CNS Spectrums,2000,5(3):52-58.

[2] 王婷,闫咏梅,曹影,等.丹红注射液治疗中风(恢复期)瘀血闭阻证的临床研究[J].中西医结合心脑血管病杂志,2014,12(2):148-149.

[3] 徐艳炜,孙莉,梁浩,等.脑缺血中12/15-脂氧合酶对过氧化物酶体增殖物激活受体γ调节作用的初步探讨[J].中华神经科杂志,2014,47(2):123-127.

[4] Ozmen S,Ayhan S,Demir Y,et al.Impact of gradual blood flow increase on ischemia-reperfusion injury in the rat cremaster microcirculationmodel[J].J Plast Reconstr Aesthet Surg,2008,61(8):939-948.

[5] 周松,陈腾,王青丽,等.丹红注射液的药理作用与临床应用概述[J].中国药师,2008,11(8):987-989.

[6] Garcia JH,Yoshide Y,Chen H,et al.Progression from is-chemic injury to infarct following middle cerrebral artery oculusin in the rat[J].Am Pathol,1993,50(142):623-625.

[7] 杨光,曾红,曾国明,等.丹红注射液对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护效应[J].国外医药,2005,26(3):158-159.

[8] 尹宏斌.红花化学成分的研究[J].中草药,2001,32(9):776.

[9] 金波,刘安东,李刚,等.丹红注射液对大鼠脑缺血再灌注后损伤的保护作用及机制研究[J].实用心脑肺血管病杂志,2009,17(1):35.

[10]王晓娟.丹参多酚酸盐对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及血管内皮生长因子表达的影响[J].环球中医药杂志,2013,(7):492.

[11]王志丹,陈少玫.失眠症中西医治疗的研究进展[J].中西医结合心脑血管杂志,2013,11(3):355-356.

[12]张莉,刘海燕.通心络胶囊联合美托洛尔治疗冠心病心力衰竭92例[J].国际中医中药杂志,2014,36(1):57-58.

[13]温晓竞,朱秀燕,张敏,等.丹红注射液对大鼠心肌缺血再灌注中一氧化氮、一氧化氮合酶和内皮素的影响[J].陕西中医,2009,30(12):1680-1681.

[14]贾凤玖,姚卫华,赵青山,等.丹红注射液和丹红注射液联合应用对急性局灶性脑缺血患者肌钙蛋白T的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2013,11(11):1385-1386.

[15]Komowski R,Fuch S,Leon MB,et al.Delivery strategies to achieve therapeutic myocardial angiogenesis[J].Circulation,2000,101(4):454-456.

[16]王鑫焱,卢国玲,李子王,等.复方丹参饮对急性心肌缺血大鼠心肌血管内皮生长因子表达的影响[J].中国中医药科技,2014,2(2):149-151.

Effect of danhong injection on vascular endothelial growth factor in rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury

LI Long-zhu1a,LIU Jia-jun1b,LI Xian-yu2,WU Sheng-ying2*,GUO Li-hong3

(1.a.Department of Gynaecology and Obstetrics,b.Department of Gastroenterology,Shiyan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shiyan 442000,China;2.Department of Pathophysiology,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;3.Department of Acupuncture,Taihe Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China)

Objective To study the effects of danhong injection on vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury.Methods Twelve rats were selected as sham operated group(control group),78 rats received right pterygopalatine artery willis ring obstruction for 60 min and reperfusion for 60 min,the operation repeated for 3 times to establish the model of rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury.Thirty-six successful model rats at 7 d after IR were randomly divided into model group,danhong A group and danhong B group.Rats in the 4 groups were medicated via tail vein injection.The protein content and mRNA expression of VEGF,hypoxia inducible factor-1a (HIF-1a) and receptor in fetal liver kinase 1 (FLK-1) were measured before treatment and at 14 d after treatment.The size of cerebral infarction was determined by brain tissue TTC staining.Results Compared with model group,the protein content and mRNA expression of VEGF,HIF-1a and FLK-1 in danhong groups were significantly higher at 14 d after treatment (P<0.05),the size of cerebral infarction reduced significantly (P<0.05).There was no significant difference in the above indexes between the two danhong groups (P>0.05).Conclusion Danhong injection can reduce the vascular endothelial cell inflammatory reaction in rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury.The mechanism may be related to the promotion of VEGF secretary,antagonism of Ca2+inner flow,relaxation of vascular smooth muscle and increasing vascular permeability etc.

Focal cerebral ischemia reperfusion injury;Danhong injection;Vascular endothelial growth factor

2014-11-21

1.湖北省十堰市中医医院a.妇产科，b.消化科，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院病理生理室，湖北 十堰 442000；3.十堰市太和医院(附属湖北医药学院)针灸科，湖北 十堰 442000

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201508005