无机盐对热带假丝酵母发酵产十二碳二元酸的影响

2015-02-23邹振东，丁海燕，孙玉梅，曹方

大连工业大学学报 2015年3期

邹振东，丁海燕，孙玉梅，曹方

（大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 116034）

0 引言

长链二元酸（long chain dicarboxylic acid，DCA）是指碳链上含有10 个以上碳原子的直链脂肪族二元酸（DCn），是一种重要的精细化工原料［1］。发酵法生产长链二元酸弥补了化学合成法生产工艺复杂、成本高、产品质量不高等不足，因而受到广泛关注［2］。目前，工业上采用发酵法大规模生产DC11－16，其中主要是利用热带假丝酵母（Candidatropicalis）代谢烷烃来生产［3－4］。

培养基组分对热带假丝酵母发酵产长链二元酸有着重要影响，该菌发酵产二元酸所用无机盐有氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾和磷酸二氢钠［5－7］。培养基中磷酸二氢钠为0.1%～0.2%，磷酸氢二钾为0.4%～0.6%有利于长链二元酸积累［8］。作者研究了无机盐对菌体发酵产十二碳二元酸的影响，以期为进一步提高菌株产二元酸能力提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

热带假丝酵母126－1菌株，大连工业大学生物工程学院实验室提供。

1.2 培养基

麦芽汁的制备：取一定量大麦，粉碎。取4倍于麦芽量的60 ℃水，在55～60 ℃下保温糖化，不断搅拌，并定时用碘液测定，直至加碘液无蓝色反应（约4～6h）。将糖化液用纱布过滤，除去残渣，煮沸后再重复用脱脂棉过滤一次，即得澄清的麦芽汁。

固体斜面培养基：将澄清的麦芽汁加水稀释至5°Bé，并加入2%琼脂，于0.1MPa灭菌20min。

液体种子培养基：玉米浆3g／L，蔗糖5g／L，尿素3g／L，磷酸二氢钾8g／L，正十二烷85.5g／L，酵母膏5 g／L，用自来水溶解，自然pH，于0.1 MPa灭菌20 min。其中尿素、正十二烷在0.05 MPa灭菌20min，接种时加入。

发酵培养基：磷酸氢二钠6g／L，蔗糖5g／L，玉米浆1g／L，氯化钠1g／L，磷酸二氢钾2g／L，酵母膏5g／L，尿素2g／L，正十二烷171.0g／L，硫酸镁1.5g／L，自来水溶解，自然pH，于0.1MPa灭菌20 min。其中尿素、正十二烷在0.05 MPa灭菌20min，接种时加入。

1.3 培养方法

菌种活化：将低温冷藏的菌种取1环划接到麦芽汁斜面培养基上，于25 ℃培养2d。

液体种子培养：在250 mL 三角瓶中装入25mL种子培养基，接入2环经斜面活化的菌体，于30 ℃、210r／min振荡培养2d。

液体摇瓶发酵：在250 mL 三角瓶中装入发酵培养基20mL和十二烷5mL，按6%的接种量接种，调pH 为7.5～8.0，于30 ℃、210r／min振荡培养6d，每天用2.5mol／L氢氧化钠调pH 为7.5～8.0。

1.4 十二碳二元酸的提取与测定

将发酵液离心弃沉淀，用滤纸过滤上清液。量取3mL过滤液置于碘量瓶中，加适量玻璃珠，在沸水浴中加热，用6mol／L盐酸调pH 至2.0～3.0，加入100 mL 乙醚，振荡碘量瓶至十二碳二元酸完全溶解于乙醚中，静置30 min 后取出50mL乙醚提取液置于100 mL 烧杯内，在通风橱中使乙醚挥发，得到析出物。用25mL 95%中性乙醇溶解析出物。加入2滴酚酞，用标准氢氧化钠溶液滴定，记录消耗的氢氧化钠体积，计算十二碳二元酸的产量［9］。

ρ＝McV1／V2

式中：M为十二碳二元酸摩尔质量，230g／mol；c为标准氢氧化钠浓度，mol／L；V1为消耗氢氧化钠体积，mL；V2为发酵液体积，mL。

2 结果与讨论

2.1 磷酸盐对菌体产酸的影响

磷酸盐除对细胞壁合成有重要作用外，还对培养液起到缓冲作用，磷酸根离子与H＋结合更有利于细胞内二元酸溢出，减少胞内积累抑制，这有利于菌体产酸。为了确定磷酸盐的最适添加量，以发酵培养基为基础，分别添加0～7g／L 的磷酸氢二钠和0～2.5g／L 的磷酸二氢钾，摇瓶发酵6d后测定菌体产酸量，测定结果如图1、2所示。

由图1、2可知，菌体产酸量受磷酸盐量的影响较显著，随着磷酸氢二钠和磷酸二氢钾添加量的上升，菌体产酸量增大，在其质量浓度分别为5.0和1.0g／L时，菌体产酸量均达到最高，分别为45.72和34.29g／L。

图1 磷酸氢二钠质量浓度对产酸量的影响Fig.1 Effect of Na2HPO4concentration on DC12yield

图2 磷酸二氢钾质量浓度对产酸量的影响Fig.2 Effect of KH2PO4concentration on DC12yield

2.2 磷酸与磷酸盐对菌体产酸的影响

磷酸盐中的金属离子可能影响菌体产酸过程中相关酶的酶活性。为了考察磷酸盐带入金属离子对菌体产酸的影响，以发酵培养基为基础，在相同磷含量下，添加磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的质量浓度分别为5.0和1.0g／L，每天测定菌体产酸量，结果如图3所示。

图3 磷酸与磷酸盐对产酸量的影响Fig.3 Effect of phosphoric acid and phosphate on DC12yield

由图3可知，随着培养时间的延长，添加磷酸盐和磷酸的实验组中菌体产酸量都呈现上升趋势，但添加磷酸的实验组增长幅度更大，可能是由于磷酸促进了菌体生长，从而有利于菌体产酸。发酵5d后，添加磷酸的培养基中菌体产酸量达到最高，为58.12g／L。在发酵6d时产酸量出现下降，可能是由于发酵后期由于碳源不足，使生成的二元酸被菌体消耗利用或者分解。因此在发酵培养基中添加磷酸不但使二元酸产量有所提高，而且相比添加磷酸盐促进菌体产酸而言，缩短二元酸生产时间，提高了经济效益。

2.3 氯化钠对菌体产酸的影响

钠离子在细胞中主要起维持渗透压的作用，这有利于细胞中物质运输。为了确定氯化钠的适宜添加量，以发酵培养基为基础，加入0～2.5g／L的氯化钠，摇瓶发酵6d后，菌体产酸测定结果如图4所示。

图4 氯化钠质量浓度对产酸量的影响Fig.4 Effect of NaCl concentration on DC12yield

由图4可知，随着氯化钠质量浓度的增加，菌体产酸量呈现下降趋势。可能是由于发酵培养基中添加的Na2HPO4已经提供了适宜的Na＋，再添加氯化钠使得细胞外渗透压升高，不利于细胞正常新陈代谢，从而影响了菌体产酸，因此在发酵培养基中不需要再添加氯化钠。

2.4 硫酸镁对菌体产酸的影响

镁离子是许多重要酶的激活剂，影响基质的氧化和蛋白质的合成。硫是构成细胞蛋白质的主要成分，也是构成一些酶的活性基［10］。为了确定硫酸镁的最适添加量，以发酵培养基为基础，加入0～2.5g／L的硫酸镁，摇瓶发酵6d后，菌体产酸测定结果如图5 所示。由图5可知，菌体产酸量受硫酸镁的影响较显著，随着硫酸镁质量浓度的增加，菌体产酸量逐渐下降。这可能是由于镁离子促进了脂肪酸β－氧化中的活化过程，使得二元酸被消耗［11］，因此发酵培养基中不应添加硫酸镁。