CD4+CD25+调节性T细胞缺陷与再生障碍性贫血的研究进展

周晨晨，胡 琦，侯文沛

(上海市中医医院，上海 200071)

综 述

CD4+CD25+调节性T细胞缺陷与再生障碍性贫血的研究进展

周晨晨，胡 琦，侯文沛

(上海市中医医院，上海 200071)

再生障碍性贫血；调节性T细胞；Foxp3；迁徙

再生障碍性贫血(aplasticanemia，AA)是一种骨髓造血衰竭综合征，以骨髓造血细胞增生减低和外周血全血细胞减少为特征，其实质是以骨髓组织为靶器官，T细胞免疫异常介导的自身免疫性疾病。CD4+CD25+调节性T细胞(regulatoryTcell，Treg)是体内一类特殊的辅助性T细胞亚群，该群细胞具有维持免疫耐受和防止自身免疫病的作用[1]。近年来大量研究证明Treg细胞缺陷与多种自身免疫性疾病的发生、发展相关，CD4+CD25+调节性T细胞缺陷包括细胞数量的减少、表达降低以及细胞功能障碍，本文就该细胞的缺陷与AA关系的作一综述。

1 Treg细胞数量与AA

在健康人中，CD4+CD25+Treg细胞约占外周血CD4+T细胞的5%～10%[2-3]。根据其起源的不同，可将Treg细胞可分为胸腺来源的天然性调节性T细胞(nature Treg，nTreg)和外周诱导的获得性调节性T细胞(inducible Treg，iTreg)，其中nTreg在参与预防异常自身免疫反应中起主要作用。Treg细胞主要通过细胞间接触途径杀伤细胞毒性细胞，抑制细胞毒性细胞产生白细胞介素-2(IL-2)等细胞因子，以及分泌抑制性细胞因子IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)这三种途径发挥免疫耐受和免疫抑制作用[4]。

Solomou等[5]首次发现，确诊再障的患者外周血单个核细胞中Treg细胞数量减低；其中7例接受免疫抑制治疗后出现造血应答的患者中，有6例的Treg细胞数量和Foxp3表达水平相对未治疗前均轻微升高；而3例接受免疫抑制治疗达到完全缓解(CR)的患者，Treg细胞数量较治疗前增加。国内王西阁等[6]研究也发现，急慢性AA患儿Treg细胞百分均低于对照组，与Solomou研究结果一至，且在SAA中Treg细胞比例进一步降低。

初始CD4+T细胞在不同的细胞因子及环境作用下可发育为功能及表型不同的辅助T细胞，如Th1细胞、Th2细胞、Treg、Th17以及滤泡辅助T细胞、Th9、Th22等[7]。其中CD4+CD25+调节性T细胞与Th17细胞关系较密切，它们功能拮抗、相互制约，共同维持机体的免疫内稳态。de Lator等[8]研究发现，AA患者Th17与Treg呈负相关。 线性回归模型分析显示，与对照相比AA患者骨髓及外周血中Th17比例增加而Treg比例较少；CR患者外周血中Th17比例较确诊时减少，而Treg比例增加；部分缓解(PR)患者较CR患者相比差异较小，但仍有显著差异。

2 Treg细胞表达与AA

Treg的表面分子B细胞内分子与其稳定和功能的发挥相关，Treg细胞主要表达白细胞介素-2受体的α链(CD25)、转录因子Foxp3、细胞毒性T淋巴抗原4(CTLA-4)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)等[9]。Foxp3分子在Treg上表达具有特异性，是目前被认为Treg最具有特征性的分子标志，是控制Treg的发育、表型和功能维持的主要调控基因[9-10]。Foxp3是转录因子叉头样/翼状螺旋(forhead/winged-helix)家族成员，其编码基因位于X染色体，在Tregs细胞维持免疫耐中受起重要作用。在小鼠体内，Foxp3基因的突变会导致严重的淋巴组织增生、淋巴细胞浸润的多组织自身免疫性反应，这种小鼠即为Scurf小鼠[11]。而在人类基因组中，Foxp3转录突变将会导致一种罕见的X连锁免疫多内分泌腺病肠病综合征(immunedysregulation，polyendocrinopathy，enteropathy，X-linked syndrom，IPEX)[12]。阻断正常来源的Tregs细胞的Foxp3表达，其免疫抑制功能将下降。

活化T细胞核因子(NFAT)是T细胞受体(TCR)介导的信号转导通路中关键的转录因子，NFAT家族成员主要包括NFAT1、NFAT2、NFAT3和NFAT4。Foxp3基因与NFAT具有许多相同的目标基因，转录因子NFAT1可通过与Foxp3的启动子结合形成Foxp3/NFAT/DNA复合物，从而促进Foxp3的表达[13]。Solomou等[5]发现，再障患者Foxp3 mRNA、蛋白水平也是显著降低的，同时伴随NFAT1蛋白水平的降低，而NFAT1蛋白水平的降低可以解释Foxp3表达的下降和Treg频率的降低[13]。王西阁等[6]研究发现，SAA组的Foxp3 mRNA表达水平明显低于对照组和NSAA组；相关性分析显示，SAA组Treg细胞数量与Foxp3 mRNA表达呈正相关。该研究提示在AA的免疫发病机制中可能存在Foxp3 mRNA的表达水平下降，从而导致Treg的免疫抑制功能不能正常发挥。

序列分析显示，Foxp3分子存在三个高度保守的位点：启动子、TGF-β敏感区和特异性去甲基化区(TSDR)[14]。Treg细胞Foxp3的启动子与TSDR的CpG基序几乎完全处于去甲基化状态，Foxp3分子CpG基序的甲基化能够阻止转录因子与其结合，或者招募抑制基因转录的分子，从而抑制Foxp3转录。Foxp3分子的转录沉默与相应调节区的甲基化相关，从而影响Treg细胞的数量，导致多种免疫性疾病的发生。Wang等[15]研究发现，在系统性硬化症中Foxp3分子甲基化水平增高，而Foxp3 mRNA水平降低，Treg细胞数量减少；用甲基化抑制因子5氮杂胞苷处理CD4+T细胞后，Foxp3甲基化水平降低，Foxp3 mRNA增加，Treg细胞数量增多；Foxp3启动子的甲基化水平与Foxp3分子的表达、疾病的严重程度相关，Foxp3启动子的甲基化导致Foxp3表达降低以及Treg细胞数量减少与系统性硬化症的免疫紊乱相关。国内也有关于Foxp3甲基化与原发性干燥综合征、系统性红斑狼疮、自身免疫糖尿病、类风湿性关节炎等免疫性疾病的相关研究。

3 Treg细胞功能障碍与AA

Treg细胞调控效应T细胞的机制是通过细胞间接触途径，因此Treg功能的正常发挥依赖于Treg迁徙至相应组织与微环境的能力。AA中骨髓作为效应T细胞的主要靶器官，因而Treg的骨髓迁徙能力在对效应T细胞的免疫抑制中起关键作用[16]。骨髓是Treg细胞重要的储存池，Treg通过基质细胞衍生因子-1α/趋化因子受体CXCR4通路即SDF-1α/CXCR4信号通路迁徙至骨髓[17]，其中CXCR4是Treg细胞迁徙至骨髓的特异性受体，而SDF-1α是目前唯一已知的Treg骨髓迁移趋化因子[18]。Shi等[19]研究发现AA患者外周血Treg迁徙能力，较正常对照组明显减低，并且SAA患者Treg迁徙力低于NSAA患者，表明Treg细胞迁徙能力的受损与AA的严重程度相关。与健康对照组相比，AA患者外周血Treg细胞趋化因子受体CXCR4 mRNA的表达水平明显降低，且SAA患者CXCR4 mRNA的表达水平低于NSAA患者，这与Treg细胞的迁徙能力相一致。同时通过ELISA检测正常对照组、SAA组、NSAA组3组血清SDF-1α，结果3组血清SDF-1α水平比较差异无统计学意义。因而，再障患者Treg细胞迁徙能力的受损，可能是由于Treg细胞趋化因子受体CXCR4表达下降，而并非是SDF-1α分泌不足对造血微环境的影响所造成的。

Shi等[19]将骨髓与所造成的外周血的Treg细胞、CD4+CD25-效应T细胞 (Tresp)、CD8+细胞毒性T细胞(Tcyt) 分离，并进行交叉共培养，结果发现AA患者外周血与骨髓Treg细胞抑制Tresp细胞、Tcyt细胞的能力均较对照组减低。交叉共培养实验显示，AA患者Treg细胞抑制对照组Tresp与Tcyt能力较低，而对照组Treg细胞对自身Tresp与Tcyt有较强的抑制力。结果表明，AA患者Treg细胞对自体效应性T细胞的免疫抑制能力受损，而健康者Treg细胞具有抑制效应性T细胞过度反应的能力。因而认为AA患者Treg细胞存在免疫抑制功能缺陷。

干扰素-γ(IFN-γ)是Th1免疫应答中重要的抑制性细胞因子，通过对CD34+造血干细胞的直接毒性作用从而损伤造血功能[20]。Shi等[19]通过细胞共培养并检测IFN-γ含量，体外实验显示AA患者Treg细胞抑制Th1产生造血负调控因子的能力降低。同时AA患者Treg及效应T细胞与造血细胞集落体外培养，结果显示AA组粒-单核细胞集落形成单位(colony forming unit-granulocyte monocyte，CFU-GM)、暴增性红细胞集落形成单位(burst forming unit-erythroid，BFU-E)、混合集落形成单位(colony forming unit-mix，CFU-mix)明显小于对照组。体外实验可表明，AA患者Treg细胞的免疫抑制缺陷造成造血功能受损。已有体外实验显示，抗胸腺细胞球蛋白(Anti-Tlymphocyte globulin，ATG)可以提高Treg细胞数量及功能[21]，因此可以推断增强Treg细胞的免疫抑制功能可以减轻AA造血损伤，促进造血功能恢复。

4 结 语

随着对CD4+CD25+调节性T细胞的免疫调节机制的深入研究，将有助于阐明AA的发病机制。AA的发生不仅与CD4+CD25+调节性T细胞数量下降、表达水平降低有关，还与Treg的骨髓迁移能力、免疫抑制功能的缺陷相关。通过修复与纠正Treg细胞数量与功能的变化，有助于重建免疫稳态，Treg相关免疫治疗提供了AA的一种新免疫治疗方向。

[1] Bettelli E,Carrier Y,Gao W,et al.Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells[J].Nature,2006,441(7090):234-238

[2] Sakaguchi S,Setoguchi R,Yaqi H,et al.Naturally arising Foxp3- expressing CD25+CD4+regulatory T cells in immunological tolerance to self and nonself[J].Nat Immunol,2005,6(4):345-352

[3] Baecher-Allan C,Brown JA,Freeman GJ,et al.CD4+CD25 high regulatory cells in human peripheral blood[J].J Immunol,2001,167(3):1245-1253

[4] Askenasy N,Kaminitz A,Yarkoni S.Mechanisms of T regulatory c-ell function[J].Autoimmunity Rev,2008,7(5):370-375

[5] Solomou E,Rezvani K,Mielke S,et al.Deficient CD4+CD25+FOXP3+T regulatory cells in acquired aplastic anemia[J].Blood,2007,110(5):1603-1606

[6] 王西阁，王晓格，栾斌，等.调节性T细胞及Foxp3基因在再生障碍性患儿外周血中的变化及意义[J].中国当代儿科杂志，2010,12(4):241-243

[7] Muranski P,Restifo NP.Essentials of Th17 cell commitment and p-lasticity[J].Blood,2013,121(13):2402-2414

[8] de Latour RP,Visconte V,Takaku T,et al.Th17 immune responses contribute to the pathophysiology of aplastic anemia[J].Blood,2010,116(20):4174-4184

[9] Hori S,Nomura T,Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3[J].Science,2003,299(5609):1057-1061

[10] Fontenot JD,Gavin MA,Rudensky AY.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J].Nat Immunol,2003,4(4):330-336

[11] Brunkow ME,Jeffery EW,Hierrild KA,et al.Disruption of a new forkhead/winged-helix protein,scurfin,results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse[J].Nat Genet,2001,27(1):68-73

[12] Torgerson TR,Ochs HD.Immune dysregulation, polyendocrinopathy,enteropathy,X-linked:forkhead box protein 3 mutations and lack of regulatory T cells[J].J Allergy Clin Immunol,2007,120(4):744-750

[13] Wu Y,Borde M,Heissmeyer V,et al.FOXP3 controls regulatory T cell function through cooperation with NFAT[J].Cell,2006,126(2):375-387

[14] Huehn J,Julia K.Polansky, Alf Hamman.Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage?[J].Nature Reviews Immunology,2009,9(2)：83-89

[15] Wang YY,Wang Q,Sun XH,at all.DNA hypermethylation of the Forkhead box protein 3 (FOXP3) promoter in CD4+T cells of patients with systemic sclerosis[J].Br J Dermatol，2014，171(1)：39-47

[16] Campbell DJ,Koch MA.Phenotypical and functional specialization of Foxp3+ regulatory T cells[J].Nat Rev Immunol,2011,11(2):119-130

[17] Zou L,Barnett B,Safah H,et al.Bone marrow is a reservoir for CD4+CD25+regulatory T cells that traffic through CXCL12/CXCR4 signals[J].Cancer Res,2004,64(22):8451-8455

[18] Lim HW,Broxmeyer HE,Kim CH.Regulation of trafficking receptor expression in human Forkhead box P3+ regulatory T cells[J].J Immunol,2006,177(2):840-851

[19] Shi J,Ge ML,Lu SH,et al.Intrinsic impairment of CD4+CD25+regulatory T cells in acquired aplastic anemia[J].Blood,2012,120(8):1624-1632

[20] Nistico A,Young NS.Gamma-interferon gene expression in the bone marrow of patients with aplastic anemia[J].Ann Intern Med,1994,120(6):463-469

[21] Shimony O,Nagler A,Gellman YN,et al.Anti-T lymphocyte globulin (ATG) induces generation of regulatory T cells, at least part of them express activated CD44[J].J Clin Immunol,2012,32(1):173-188

胡琦，E-mail：summer_dreaming@126.com

上海市自然科学基金资助项目(11ZR1434600)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.20.040

R0556.5

A

1008-8849(2015)20-2269-03

2014-08-30