中草药制剂对热应激奶牛泌乳性能、抗氧化能力及免疫功能的影响

胡永灵，叶世莉，罗佳捷

（1．湖南环境生物职业技术学院，湖南衡阳421005；2．衡阳市富矿饲料添加剂公司，湖南衡阳421004；3．湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙410128）

中草药制剂对热应激奶牛泌乳性能、抗氧化能力及免疫功能的影响

胡永灵1*，叶世莉2，罗佳捷3

（1．湖南环境生物职业技术学院，湖南衡阳421005；2．衡阳市富矿饲料添加剂公司，湖南衡阳421004；3．湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙410128）

为探讨复合中草药制剂对热应激奶牛泌乳性能、抗氧化能力及免疫功能的影响，选择产奶中后期的健康中国荷斯坦奶牛20头，按泌乳时间和产奶量相近的原则均分为A、B、C和D 4组。A组为对照组，饲喂基础日粮；B、C和D组分别在每头牛的基础日粮中添加50，100和150 g／d水平的复合中草药制剂。每天测定产奶量，在试验的第1（添加复合中草药制剂之前）、20和40天逐头采集血样，测定不同剂量复合中草药制剂对热应激奶牛血淋巴细胞凋亡率、血液抗氧化酶GSH-Px、CAT基因及血淋巴细胞凋亡相关基因Bcl-2、p53表达水平的影响。结果表明，B、C和D组的日产奶量较对照组分别提高了20．26%（P＜0．05），24．20%（P＜0．05）和16．98%（P＞0．05）；乳中体细胞数较对照组分别降低了21．68%（P＜0．05），29．88%（P＜0．05）和24．22%（P＜0．05）；奶牛血液抗氧化酶GSH-Px、CAT基因的表达水平分别比对照组提高了5．00%（P＞0．05），13．00%（P＜0．05），6．00%（P＞0．05）和5．00%（P＞0．05），16．00%（P＜0．05），3．00%（P＞0．05）；奶牛血淋巴细胞平均凋亡率分别比A组降低了18．20%（P＞0．05），17．86%（P＞0．05）和12．51%（P＞0．05）；奶牛血淋巴细胞Bcl-2在20，40 d时均极显著高于A组，全期的平均水平分别比对照组高出105．00%（P＞0．05），113．00%（P＞0．05）和57．00%（P＞0．05）；p53基因的表达水平在20，40 d时均极显著低于A组，全期的平均水平分别比对照组降低了24．00%（P＞0．05），28．00%（P＞0．05）和20．00%（P＞0．05）。试验组中，C组奶牛的日产奶量、体细胞数、血液抗氧化酶活性、淋巴细胞凋亡相关基因表达等指标要优于B、D组；而血液淋巴细胞凋亡率指标为B组最好。说明复合中草药制剂能有效改善热应激奶牛的泌乳性能、抗氧化能力及免疫功能，且在本试验条件下，每头牛日粮中添加100 g／d水平的效果要优于50及150 g／d水平。

奶牛；中草药；泌乳性能；抗氧化能力；免疫功能

奶牛养殖是我国畜牧业生产中的一个重要组成板块，饲料营养与配制、生产环境是健康优质奶源的重要保障。近年来我国学者们在通过调整饲料组合、调制方法等来提高奶牛的生产性能等方面进行了大量的研究，也取得了丰硕的成果［1-3］。生产环境的变化特别是我国夏季炎热高温是一个普遍现象，当牛舍的温湿指数（THI）大于72时，奶牛便处于热应激状态［4］，而热应激对奶牛的生产性能、繁殖性能及免疫性能等方面均有非常不利的影响［5-7］，因此，探索减少或缓解热应激的途径一直是奶牛饲养业特别是南方奶牛饲养业的重大课题之一。天然中草药是我国民间传统瑰宝，其中一部分具有消炎、补充营养、改善机体免疫状态、促进生长和提高饲料转化率等多种功效，由于它无抗药性和耐药性，无药物残留和不良反应少，在畜禽养殖方面显示出独特的优势［8］。近年来，有关学者对中草药制剂在奶牛抗热应激［9-12］、改善奶牛抗氧化性能［13-14］及免疫性能［15-16］等方面的作用效果进行了初步研究，但欠深入。有研究指出，人体抑癌基因（p 53）能通过促进机体细胞凋亡来削弱机体抗应激的能力［17］，而抗细胞凋亡的B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）能有效提高机体对抗热应激的能力［18］；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）与超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）均是生物机体内重要的抗氧化酶，在清除自由基、H2O2和过氧化物以及减少羟基自由基形成等方面发挥着十分重要的作用［19-20］，而中草药制剂对奶牛体内抗氧化酶、细胞凋亡相关基因表达及淋巴细胞凋亡率的影响尚未见报道。本研究拟探索复合中草药制剂对奶牛体内GSH-Px、CAT、Bcl-2、p53基因表达及淋巴细胞凋亡率的影响，为揭示中草药制剂调控奶牛抗热应激机理的理论研究及其在奶业安全生产中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 试验时间和地点

试验在湖南省畜牧兽医研究所奶牛原种场进行，试验期为2013年6月7日至7月16日，其中，前7 d为预饲期。

1．2 中草药添加剂的制备

由衡阳市某饲料添加剂有限公司研制生产并提供。根据中医药理论，选用具有清热解暑、凉血解毒、益气养阴、加强免疫机能的中药材进行组方，包括王不留行、山药、何首乌、益母草、山楂、泽泻、菟丝子、蛇床子、漏芦、白芍、乌药和黄芪等，以我国中医药传统的炮制方法为基础，采用发酵工艺与现代微纳米技术及工艺，将其制成3～5μm直径颗粒的复合中草药制剂。

1．3 试验动物的选择、分组及试验设计

根据奶牛的产奶量和泌乳时间相近的原则选取20头健康的泌乳中后期中国荷斯坦奶牛，随机均分成A、B、C和D 4组，每组5个重复，每个重复1头牛。A组为对照组，饲喂基础日粮；B、C和D组分别在每头牛的基础日粮中添加50、100和150 g／d水平的中草药制剂，预饲7 d，正式试验期33 d。分组及处理见表1。

1．4 试验日粮及饲养管理

奶牛基础日粮及饲喂量主要为青贮玉米秸秆15 g／d、矮象草10 kg／d、啤酒糟8 kg／d及配合精料4 kg／d，精料参照《奶牛营养需要》（第7版）［21］配制，配方及营养成分见表2。试验奶牛集中在一栋栏舍饲养，统一管理。试验期间每天分别在5：30和15：00喂料，6：00和17：30挤奶，自由饮水，夜间运动场放牧。中草药添加剂在喂料时添加至精料中，搅拌均匀；预试期前3 d添加量为正式期的1／3，后4 d为2／3。

1．5 环境温湿度及产奶性能测定

在牛舍内两侧牛床上方距地面1．5 m高处悬挂温湿度计，试验期间每天于5：30和14：00记录温度和相对湿度，并计算温湿指数。采用全封闭鱼骨式挤奶厅系统流量计记录每头牛每天的产奶量；试验结束时，按6∶4比例收集早、晚两次奶样，混合后用于测定乳脂率、乳蛋白率、体细胞数，在上海奶牛生产测定中心实验室用全自动乳成分仪（丹麦，FOSS）测定。

1．6 采样

在试验期的第1，20和40天分别从供试奶牛的颈静脉采血。每头牛每次采血约为40 m L，分装成4管（每管10 m L），用肝素钠抗凝全血，其中2管马上用牛淋巴细胞分离液（北京索莱宝公司）分离淋巴细胞，用冻存液悬浮后放入液氮保存。

1．7 基因表达分析

1．7．1 引物设计及合成 基因表达分析采用荧光定量RT－PCR法，根据网上（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）发表的基因序列，以Beta-actin m RNA作内参，根据GenBank中奶牛的GSH-Px、CAT、Bcl-2、p 53和Beta-actin的基因登陆序列（依次为NM001035386、NM174077、BTU92434、BC102440．1和BC142413），用Primer Premier 5．0软件设计引物（表3）。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1．7．2 血液总RNA及淋巴细胞RNA的提取 血液淋巴细胞用北京索莱宝科技有限公司生产的淋巴细胞分离液进行提取；总RNA的提取采用日本基因株式会社的ISOGEN-LS总RNA抽提试剂盒，并按其说明书操作。所有过程均在无菌操作台上进行。

1．7．3 反转录cDNA 采用Revert Aid TM First Strand cDNA Systhesis Kit反转录试剂盒，按试剂盒说明书操作。

1．7．4 cDNA的RT－PCR反应体系 GSHPx、CAT、Bcl-2和p 53的荧光定量RT－PCR反应体系各成分及加样量见表4。反应条件为：95℃预变性1 min，进行如下循环：95℃15 s，60℃15 s，72℃45 s；35个循环后，72℃延伸7 min，4℃保存。

1．7．5 RT－PCR产物的检测与相对定量所得产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测条带，条件为：90 V，60 min，凝胶电泳成像系统成像，以50 bp Marker作对照检验目标条带大小是否与β-actin产物大小相同。本试验中将cDNA样品进行1，5，25，125，625，3125倍稀释，对目的基因和内参基因进行PCR扩增，以cDNA稀释倍数取对数值为横坐标，△Ct值为纵坐标作图，得到回归线Y＝0.0629X＋6.058，R2＝0.55，曲线斜率为0．0629，说明目的基因和内参基因扩增效率基本一致，可以用2－△△Ct法计算本试验中基因相对表达量，即以对照组基因表达量为1倍，处理组表达量为相对于对照组的表达倍数。

1．8 淋巴细胞凋亡率的测定

将冻存的细胞放入水浴锅（37℃）迅速解冻，1500 r／min离心10 min，吸除上清，加入1 m L冰浴预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）重悬细胞并转移至1．5 m L离心管，再次离心并吸除上清，加入1 m L冰浴预冷的70%浓度的乙醇，反复吹打以避免细胞成团，固定24 h后离心并弃去上清，加入1 m L冰浴预冷的PBS重悬细胞，再次离心并吸除上清，加入0．5 m L碘化丙啶染色液（碧云天生物技术研究所）37℃避光孵育30 min后上流式细胞仪（Beckman Coulter，EPICS XL／-MCL）检测。

1．9 数据处理与统计分析

数据用Excel进行初步处理后，再使用SPSS 17．0统计软件进行成对样本差异显著性检验，结果用平均值±标准误表示，检验误差为5%和1%水平。

2 结果与分析

2．1 复合中草药制剂对奶牛产奶性能的影响

由表5可知，不同剂量复合中草药制剂的添加对于维持奶牛的产奶量具有明显的效果，虽然整体产奶量均较试验开始前有所下降，但3个试验组奶牛的产奶量分别比对照组高出20．26%（P＜0．05），24．20%（P＜0．05）和16．98%（P＞0．05），其中，B、C组达到显著水平；复合中草药制剂对乳脂率和乳蛋白率的影响不显著（P＞0．05），但对乳中体细胞数影响显著，B、C和D组分别较对照组降低了21．68%（P＜0．05），29．88%（P＜0．05）和24．22%（P＜0．05）。

2．2 复合中草药制剂对奶牛血液抗氧化酶基因表达水平的影响

由表6可知，在添加复合中草药制剂之前，各组奶牛血液GSH-Px基因的表达水平之间不存在显著差异，添加了复合中草药制剂之后，各试验组奶牛血液GSH-Px基因的表达水平均呈现出上升的趋势，3个试验组在第20和40天时的表达水平较对照组分别高出6．00%（P＞0．05），15．00%（P＞0．05），4．00%（P＞0．05）和10．00%（P＞0．05），22．00%（P＜0．05），10．00%（P＞0．05），其中C组在第40天时的涨幅达到显著水平；从整个试验期的平均水平来看，3个试验组比对照组分别高出5．00%（P＞0．05），13．00%（P＜0．05）和6．00%（P＞0．05），C组达到显著水平。说明复合中草药制剂能有效提高热应激奶牛血液抗氧化酶GSH-Px基因的表达水平。

各组奶牛血液CAT基因的表达水平在添加复合中草药制剂前不存在显著差异（表6）。在试验的第20和40天，3个试验组奶牛血液CAT基因的表达水平较对照组分别升高了8．00%（P＞0．05），20．00%（P＞0．05），4．00%（P＞0．05）和9．00%（P＞0．05），26．00%（P＜0．05），6．00%（P＞0．05），其中，C组在第40天时及全期的增幅达到显著水平。从全期的平均水平来看，3个试验组的涨幅分别达到5．00%（P＞0．05），16．00%（P＜0．05）和3．00%（P＞0．05），C组与对照组之间存在显著差异。说明复合中草药制剂在提高热应激奶牛血液抗氧化酶CAT基因的表达水平方面具有明显的效果。

2．3 复合中草药制剂对奶牛血液淋巴细胞凋亡率及其相关基因表达水平的影响

由表7可知，各组奶牛血淋巴细胞凋亡率在试验开始之前不存在显著差异，添加复合中草药制剂之后，B、C组奶牛在第20天时的血淋巴细胞凋亡率较对照组显著降低，降幅分别达到21．01%（P＜0．05）和23．64%（P＜0．05），到第40天时，3个试验组奶牛的血淋巴细胞凋亡率较对照组分别降低了27．45%（P＜0．01），27．36%（P＜0．01）和24．55%（P＜0．01），均达到极显著水平；就整个试验期而言，3个试验组奶牛的血淋巴细胞凋亡率较对照组分别降低了18．20%（P＞0．05），17．86%（P＞0．05）和12．51%（P＞0．05）。该结果表明复合中草药制剂能有效降低热应激奶牛外周血淋巴细胞的凋亡率。

各组奶牛血淋巴细胞Bcl-2基因表达水平在试验开始之前不存在显著差异（表8）。添加复合中草药制剂后，3个试验组奶牛血淋巴细胞Bcl-2基因的表达水平较对照组相比均有不同程度的降低，其中，B、C组在第20及3个试验组在第40天时的增幅均达到极显著水平（P＜0．01），D组在第20天时的增幅也达到显著水平（P＜0．05），从整个试验期的平均水平来看，B、C和D组较对照组的增幅分别达到105．00%（P＜0．01），113．00%（P＜0．01）和57．00%（P＞0．05）。结果说明复合中草药制剂对热应激奶牛血淋巴细胞Bcl-2基因表达水平的影响非常显著。

各组奶牛血淋巴细胞p 53基因的表达水平在添加复合中草药制剂之前不存在显著差异。试验开始之后，B、C和D组在第20和40天时较对照组的降幅均达到极显著水平（P＜0．01），就整个试验期的平均水平来看，3个试验组较对照组分别降低了24．00%（P＞0．05），28．00%（P＞0．05）和20．00%（P＞0．05）。说明复合中草药制剂的添加能有效降低热应激奶牛血淋巴细胞p53基因的表达水平。

3 讨论

3．1 复合中草药制剂对热应激奶牛生产性能的影响

奶牛受热应激的影响，直肠温度、呼吸频率和脉搏等3项生理常数指标均会显著升高，这直接影响到奶牛的采食量，并最终导致产奶量的显著下降［22］。在本研究中，测定的牛舍温湿指数在整个试验期一直大于72，说明奶牛一直处于热应激状态，各组奶牛的产奶量较试验开始前也出现了不同程度的降低，其中，对照组的降幅达到30．42%，而复合中草药制剂的添加对维持奶牛的产奶量表现出一定的效果，3个试验组奶牛的产奶量较对照组分别高出了20．26%、24．20%和16．98%，这可能是由于复合中草药制剂对奶牛热应激有较好的缓解作用［23］，能有效清除热应激产生的过量自由基［24］，增强奶牛机体抗氧化功能，进而提高采食量，改善奶牛的产奶性能。其中，B、C组的乳蛋白率和B、D组的乳脂率较对照组有所降低，但由于日产奶量的提高幅度较大，因此，总的乳脂产量和乳蛋白产量仍然较对照组有明显的升高；但D组的乳脂率和C组的乳蛋白率又较对照组有所提高，这可能是因为奶牛个体之间的差异以及奶牛在热应激条件下自行选择采食的日粮结构组成存在差异，比如青饲料和精料的比例不同。另外，3个试验组奶牛乳中体细胞数较对照组分别降低了21．68%、29．88%和24．22%，说明复合中草药制剂能对热应激奶牛起到一定的保健作用，增强机体的免疫能力，抑制炎症的发生。

3．2 复合中草药制剂对热应激奶牛血液抗氧化酶基因表达水平的影响

基于抗氧化酶GSH-Px和CAT对机体抗氧化应激的重要性，本研究探索了复合中草药制剂对热应激奶牛血液GSH-Px和CAT基因表达的影响。GSH-Px、SOD和CAT一起构成了生物体内活性氧防御系统，机体对活性氧O2-的第1道防线是SOD，它将O2-转化为过氧化氢和其他氢过氧化物；第2道防线是CAT和GSH-Px，其中CAT可清除过氧体系中的H2O2，而GSH-Px分布在细胞的胞液和线粒体中，可同时清除H2O2和氢过氧化物，从而有效地保护机体［25］。前人的研究表明，自由基数量的减少等能增强GSH-Px、SOD和CAT等抗氧化酶基因的表达水平，进而阻断脂质过氧化链式反应，缓解膜脂质过氧化，提高机体抗氧化应激能力并减少细胞的损伤［26］。在本研究中，复合中草药制剂的添加显著提高了热应激奶牛血液GSH-Px和CAT基因的表达水平，说明奶牛的抗氧化能力得到了显著提高。这是由于复合中草药制剂中富含黄酮类、多酚类和鞣质类化合物，黄酮类物质能通过酚羟基与自由基生成稳定的半醒自由基，通过抗氧化剂的还原作用直接给出电子而清除自由基；多酚类化合物是极好的氢或电子供体，结构稳定，不会引发新的游离基或者由于链反应而被迅速氧化，所以有很好的抗氧化效果；而鞣质类物质的抗氧化性主要体现在其通过还原反应降低环境中氧含量，或作为氢供体与环境中自由基结合，终止自由基引发的连锁反应［24］。复合中草药制剂中的抗氧化类化合物共同作用，促进过量自由基的清除，提高抗氧化酶基因的表达水平，并最终改善奶牛机体的抗氧化能力。

3．3 复合中草药制剂对热应激奶牛血淋巴细胞凋亡率及其相关基因表达水平的影响

有研究表明，热应激能显著增加奶牛［27-28］和藏獒［29］外周血淋巴细胞的凋亡率，但在热应激初期奶牛具有一定的自身调节能力来减弱热应激反应［30］。在本研究中，试验期的奶牛一直处于热应激状态下，热应激对奶牛淋巴细胞造成了极大的损伤，对照组奶牛在试验第20和40天时的淋巴细胞凋亡率分别比试验开始前升高了101．96%和116．11%，3个试验组奶牛的淋巴细胞凋亡率也较试验开始前有所升高，但复合中草药制剂的添加对于降低淋巴细胞的损伤还是表现出了显著的效果，凋亡率的平均水平较对照组分别降低了18．20%，17．86%和12．51%。Bcl-2是动物机体内重要的抗凋亡基因，能够有效延长细胞周期［31］；p53调控一些仅有BH3区域的蛋白，诱导细胞凋亡的功能十分显著［32-33］。p 53作为促细胞凋亡因子，其高表达能减少Bcl-2的表达，促进细胞凋亡；而Bcl-2又能抑制p 53介导的细胞凋亡。当p 53基因失活时，引起Bcl-2家族基因调控失衡，凋亡抑制基因Bcl-2的表达水平升高，导致靶细胞不易诱发细胞凋亡［34］，因而p53与Bcl-2家族基因的调控作用是相互联系的。在本研究中，复合中草药制剂的添加有效地降低了p53基因的表达并增加了Bcl-2基因的表达，因此，能有效的降低淋巴细胞的凋亡率，增强奶牛机体的细胞免疫和体液免疫能力，并最终减轻热应激对奶牛机体造成的损伤。

3．4 复合中草药制剂的剂量效应

在本研究中，综合考虑各指标，给每头牛添加100 g／d水平复合中草药制剂的效果要好于50和150 g／d水平。总结其原因，100 g／d添加水平效果要优于50 g／d添加水平的原因可能是因为50 g／d的添加剂量还略为偏低，虽然也有比较明显的效果，但还是赶不上100 g／d添加水平的效果；而150 g／d添加水平的效果不如100 g／d添加水平的原因可能是由于中草药添加剂有一定的苦味，在炎热的天气条件下，较高剂量的摄入对奶牛会产生味觉上的刺激，会使奶牛机体产生一定程度的应激，尽管如此，它起到的正向功效还是不容忽视的。从实际使用效果及经济收益方面来考虑，每头牛100 g／d的添加水平最为适宜。

4 结论

复合中草药制剂能有效改善热应激条件下奶牛的泌乳性能；复合中草药制剂能通过提高GSH-Px和CAT基因的表达水平在一定程度上改善奶牛机体的抗氧化性能；复合中草药制剂能通过提高Bcl-2的表达水平并降低p53基因的表达水平来抑制热应激奶牛外周血淋巴细胞的凋亡率，进而改善奶牛机体的免疫功能；在本研究条件下，给每头牛添加100 g／d水平的效果最好。

Reference：

［1］ Yuan J，Wang X J，Zhang J P，et al．Effect of concentrate-roughage ratio and rapeseed meal supplementation on associated effects of diets in vitro．Acta Prataculturae Sinica，2014，23（1）：291-199．

［2］ Wang J，Wang Y Q，Wen A Y，et al．Effects of molasses addition on the fermentation quality of broccoli residue，rice straw and alfalfa mixed silage．Acta Prataculturae Sinica，2014，23（3）：248-254．

［3］ Ding W R，Guo X S，Yang F Y．Influences of moisture and compound additives on the quality of alfalfa hay during storage．Acta Prataculturae Sinica，2014，23（3）：241-247．

［4］ Lemerle C，Goddard M E．Assessment of heat stress in dairy cattle in Papua New Guinea．Tropical Animal Health and Production，1986，18（4）：232-242．

［5］ West J W．Effects of heat-stress on production in dairy cattle．Journal of Dairy Science，2003，86：2131-2144．

［6］ Li J G．Influence of heat stress on physiological response，blood biochemical parameters，reproduction and milk performance of holstein cow．Journal of Agricultural University of Hebei，1998，21（4）：69-75．

［7］ Gwazdauskas F C．Effects of climate on reproduction in cattle．Journal of Dairy Science，1985，68：1568-1578．

［8］ Wang F X，Zheng B L，Wang J Q．Effect of Chinese herbal medicine on milk performance in different lactation period．Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，2013，（7）：54-56．

［9］ Zhan J S，Wu L Z，Li L L，et al．Effect of metallothionein on lymphocyte apoptosis of the dairy cow cultured in vitro under heat stress．ActaPrataculturae Sinica，2014，23（3）：215-223．

［10］ Liu H L．The effects of Chinese herbal medicine-based anti-heat stress additives on production performance，physiological and biochemical of dairy cattle［D］．Changsha：Hunan Agricultural University，2010．

［11］ Wu Q L，Jin L M，Jin B F，et al．Effect of Chinese herbal medicine on anti-heat stress in dairy cattle．Chinese Journal of Animal science，2007，43（1）：31-34．

［12］ Jin L M，Wu Q L，Jin B F，et al．Influence of anti-heat stress Chinese herbal medicine additive on amount of milk and blood biochemical parameters in dairy cow．Chinese Journal of Veterinary Science，2008，28（7）：852-857．

［13］ Jia B，Liu S J，Zhang A Z，et al．The effect of Chinese herbal medicine additive on milk performance and serum biological，antioxidant indexes in cows．China Dairy Cattle，2011，（6）：12-16．

［14］ Zheng H C，Lu C，Zhang G Z，et al．Effect of Chinese herbal medicine on milk performance and blood oxidation of dairy cow in summer．Journal of Chinese Traditional Veterinary Medicine，2010，（3）：7-11．

［15］ Chen X W．Effect of Chinese herbal medicine on immune performance in dairy cow．China Dairy Cattle，2010，（7）：44-46．

［16］ Sun Q Y．Effects of Chinese herbal feed additives on immunologic and productive functions in dairy cattle．Journal of Anhui Agricultural Science，2010，38（17）：9026-9028．

［17］ Santini D，Tonini G，Vecchio F M，et al．Prognostic value of Bax，Bcl-2，p53，and tunel staining in patients with radically resected ampullary carcinoma．Journal of Clinical Pathology，2005，58（2）：159-165．

［18］ Song X L，Qian L J，Li F Z，et al．Mechanisms of protection effect of bcl-2 gene transfection on heat stressed cardiomyocytes．Chinese Journal of Applied Physiology，2002，18（4）：347-349．

［19］ Li L L，Hou Z P，Yin Y L，et al．Intramuscular administration of zinc metallothionein to preslaughter stressed pigs improves anti-oxidative status and pork quality．Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，2007，20（5）：761-767．

［20］ Mccord J M．Oxygen-derived free radicals in postischemic tissue injury．New England Journal of Medicine，1985，312：159．

［21］ Meng Q X．Nutrient Requirements of Dairy Cattle［M］．Beijing：China Agricultural University Press，2002．

［22］ Yang Y，Liang R R，Liu Q H，et al．The influence of heat stress，from mild to medium，on physiological index and milk yield of holstein lactating cows．Chinese Agricultural Science Bulletin，2009，25（24）：28-31．

［23］ Li Z F，Xue B，Wang L Z，et al．Effect of radix astragali complex Chinese herbal medicinal additive on anti-heat stress and mechanism in dairy cow．Chinese Journal of Animal Science，2012，48（1）：51-55．

［24］ Zhou J．The antioxidant effect of Chinese herbal medicine on free radical．Journal of Hotan Teachers College，2009，28（1）：200-201．

［25］ Ursini F，Maiorini M．Purification from pig liver of a protein which protects liposomes and biomembranes from peroxidative degradation and exhibits glutathione peroxidase activity on phosphatidylchoIine hydroperoxides．Biochimicaet Biophysica Acta，1982，710：192．

［26］ Riazantseva N V，Novitski V V，Chasovskikh N，et al．Redox-dependent regulation of apoptosis as a function of intracellular reactive oxygen species in oxidative stress．Rossivskaia Aka-demiia Nauk，2008，94（6）：710-718．

［27］ Li Z H，Kong L J，Liu Q H，et al．Relationship of antioxidant index in peripheral blood and lymphocyte apoptosis for Holstein dairy cattle under different tanperature-humidity index．Journal of Fujian Agriculture and Forestry University（Natural Science Edition），2008，37（3）：280-285．

［28］ Cai Y F，Li L，Liu Q H，et al．Analysis of apoptosis and expression of bax-αof lymphocytes in peripheral blood of dairy cows．Journal of Nanjing Agricultural University，2005，28（1）：66-70．

［29］ Di H S，Wang L G，Zheng X F，et al．Effects of temperature-humidity index on apoptosis and HSP70 protein expression of lymphocyte in peripheral blood of Tibetan Mastiff．Jiangsu Agricultural Sciences，2011，39（5）：271-273．

［30］ Cai Y F，Du J，Zhang L J，et al．Expression of apoptosis-related genes and blood index in lymphocytes in peripheral blood of dairy cows．Acta Zoologica Sinica，2005，51（2）：286-293．

［31］ Vaux D L，Cory S，Adams J M．Bcl-2 gene promotes haemopoietic cell survival and cooperates with c-myc to immortalize pre-B cells．Nature，1988，335（6189）：440-442．

［32］ Alvarez S，Drane P，Meiller A．A comprehensive study of p53 transcriptional activity in thymus and spleen of gamma irradiated mouse：High sensitivity of genes involved in the two main apoptotic pathways．International Journal of Radiation Biology，2006，82（11）：761-770．

［33］ Vanlandingham J W，Tassabehji N M，Somers R C，et al．Expression profiling of p53-target genes in copper-mediated neuronal apoptosis．Neuromolecular Medicine，2005，7（4）：311-324．

［34］ Zhan Q，Alamo I，Yu K，et al．The apoptosis-associated gamma-ray response of Bcl-xl depends on normal p53 function．Oncogene，1996，13（10）：2287-2293．

［1］ 袁玖，万欣杰，张金萍，等．不同精粗比和菜粕水平对饲粮组合效应的影响．草业学报，2014，23（1）：291-299．

［2］ 王坚，王亚琴，闻爱友，等．糖蜜添加对西兰花茎叶稻秸苜蓿混合青贮发酵品质的影响．草业学报，2014，23（3）：248-254．

［3］ 丁武蓉，郭旭生，杨富裕．水分及复合添加剂对苜蓿干草贮藏品质的影响．草业学报，2014，23（3）：241-247．

［6］ 李建国．热应激对奶牛生理常值、血液生化指标、繁殖及泌乳性能的影响．河北农业大学学报，1998，21（4）：69-74．

［8］ 王凤霞，郑宝莲，王建强．中草药饲料添加剂对奶牛不同泌乳阶段泌乳性能的影响．黑龙江畜牧兽医：科技版，2013，（7）：54-56．

［9］ 占今舜，吴力专，李丽立，等．金属硫蛋白对热应激下体外培养奶牛淋巴细胞的影响．草业学报，2014，23（3）：215-223．

［10］ 刘海林．中草药及复合添加剂对奶牛热应激生产性能、生理和血清生化指标的影响研究［D］．长沙：湖南农业大学，2010．

［11］ 伍清林，金兰梅，金保方，等．中草药添加剂对奶牛抗热应激作用的研究．中国畜牧杂志，2007，43（1）：31-34．

［12］ 金兰梅，伍清林，金保方，等．抗热应激中草药添加剂（夏安散）对奶牛产奶量和血液生化指标的影响．中国兽医学报，2008，28（7）：852-857．

［13］ 贾斌，刘守江，张爱忠，等．中草药饲料添加剂对奶牛产奶性能及血液生化和抗氧化指标的影响．中国奶牛，2011，（6）：12-16．

［14］ 郑会超，陆诚，张高振，等．中草药添加剂对夏季奶牛产奶性能及血液氧化状态的影响．中兽医学杂志，2010，（3）：7-11．

［15］ 陈现伟．中草药制剂对泌乳奶牛机体免疫性能的影响．中国奶牛，2010，（7）：44-46．

［16］ 孙齐英．抗热应激中草药添加剂对奶牛免疫功能及生产性能的影响．安徽农业科学，2010，38（17）：9026-9028．

［18］ 宋学立，钱令嘉，李凤芝，等．Bcl-2基因转染对热应激心肌细胞保护作用的机制探讨．中国应用生理学杂志，2002，18（4）：347-349．

［21］ 孟庆翔．奶牛营养需要［M］．北京：中国农业大学出版社，2002．

［22］ 杨毅，梁荣嵘，刘庆华．轻微至中度热应激对荷斯坦奶牛生理指标及产奶性能的影响．中国农学通报，2009，25（24）：28-31．

［23］ 李占锋，薛白，王立志，等．黄芪组方中草药添加剂抗奶牛热应激效果及其作用机理的研究．中国畜牧杂志，2012，48（1）：51-55．

［24］ 周静．中草药的天然抗氧化效果及其对运动源性自由基的影响．和田师范专科学校学报，2009，28（1）：200-201．

［27］ 李忠浩，孔丽娟，刘庆华，等．不同温湿指数下荷斯坦奶牛外周血抗氧化指标的变化及其与淋巴细胞凋亡的关系．福建农林大学学报（自然科学版），2008，37（3）：280-285．

［28］ 蔡亚非，李莲，刘庆华，等．热应激奶牛外周血淋巴细胞凋亡和bax-α基因表达．南京农业大学学报，2005，28（1）：66-70．

［29］ 狄和双，王利刚，郑筱峰，等．不同温湿指数对藏獒外周血淋巴细胞凋亡及HSP70蛋白表达的影响．江苏农业科学，2011，39（5）：271-273．

［30］ 蔡亚非，杜鹃，张利军，等．热应激奶牛外周血淋巴细胞凋亡相关基因的表达及血液学分析．动物学报，2005，51（2）：286-293．

Effect of Chinese herbal medicine on milk production，antioxidant capacity and immunity of dairy cows

HU Yongling1*，YE Shili2，LUO Jiajie3
1.Hunan Environmental Biological Vocational and Technical College，Hengyang 421005，China；2.Hengyang Fukuang Feed Ad ditive Company，Hengyang 421004，China；3.College of Animal Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China

The effect of compound Chinese herbal medicine on milk performance，antioxidant capacity and immunity of dairy cows was studied in 20 healthy mid to late lactation Chinese Holstein cows．Based on lactationtime and milk yield，cows were divided into four equal size groups（A，B，C and D）．Group A（control）was feed the base diet only（no herbal medicine），whereas group B，C and D were feed the basal diet supplemented with 50，100 and 150 g／d of the Chinese herbal medicine，respectively．The milk yield for each cow was measured daily．Blood samples for each cow under heat stress conditions were collected on the 1st，20th and 40th day following implementation of treatments to determine apoptosis rate of lymphocytes，GSH-Px，and gene expression of CAT and lymphocyte apoptosis related gene，Bcl-2，p53．Cows in group B，C and D produced 20．26%，24．20%and 16．98%more milk than those in group A（P＜0．05），respectively．The somatic cell counts in milk from group B，C and D were 21．68%，29．88%and 24．22%（P＜0．05）lower than that group A，respectively．The mean level of GSH-Px and CAT gene expression in group B，C and D was greater than that in group A by 5．00%（P＞0．05），13．00%（P＜0．05），6．00%（P＞0．05）and 5．00%（P＞0．05），16．00%（P＜0．05），3．00%（P＞0．05），respectively．The apoptosis rate of lymphocyte in cows from group B，C and D were 18．20%（P＞0．05），17．86%（P＞0．05）and 12．51%（P＞0．05）lower than those in group A，respectively．The expression level of Bcl-2 in group B，C and D was 105．00%（P＞0．05），113．00%（P＞0．05）and 57．00%（P＞0．05）higher than that in group A，respectively．Additionally，the expression level of p53 gene in groups B，C and D were 24．00%（P＞0．05），28．00%（P＞0．05）and 20．00%（P＞0．05）lower than that in the control group，respectively．The gene expression level of Bcl-2 and p53 was significantly higher in groups（B，C and D）than that in control group after 20 and 40 days．Within the groups receiving Chinese medicine，milk yield，somatic number，antioxidase activity and expression level of lymphocytic apoptosis related genes were higher in group C than other groups，while the apoptosis rate of lymphocyte in group B was highest．This study suggested that compound Chinese herbal medicine can improve milk performance，antioxidant capacity and immunity of dairy cattle under heat stress．

dairy cattle；Chinese herbal medicine；milk performance；antioxidant capacity；immunity

10．11686／cyxb20150117 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

胡永灵，叶世莉，罗佳捷．中草药制剂对热应激奶牛泌乳性能、抗氧化能力及免疫功能的影响．草业学报，2015，24（1）：132-140．

Hu Y L，Ye S L，Luo JJ．Effect of Chinese herbal medicine on milk production，antioxidant capacity and immunity of dairy cows．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（1）：132-140．

2014-05-12；改回日期：2014-07-18

国家教育部、财政部支持的国家重点专业建设项目［2011（71）］和湖南省高等学校科学研究项目（11C0468）资助。

胡永灵（1969-），男，湖南衡阳人，副教授，硕士。E-mail：huyonglin19＠163．com

*通讯作者Corresponding author．E-mail：962567227＠qq．com