禾草内生真菌的多样性及意义

金文进，李春杰，王正凤

（1．甘肃工业职业技术学院化工学院，甘肃天水741025；2．草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学草地农业科技学院，甘肃兰州730020；3．白银市农业科学研究所，甘肃白银730900）

禾草内生真菌的多样性及意义

金文进1，2，李春杰2*，王正凤3

（1．甘肃工业职业技术学院化工学院，甘肃天水741025；2．草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学草地农业科技学院，甘肃兰州730020；3．白银市农业科学研究所，甘肃白银730900）

禾草内生真菌是一个多样性十分丰富的微生物类群，因其具有重要的生理和生态作用而成为当前国内外研究的热点。禾草内生真菌的多样性主要有种的多样性、宿主多样性、生境多样性、形态多样性以及遗传多样性。主要是感染冷季型禾草的香烛菌属（Epichloë）及其无性态Neotyphodium属。全球生态环境复杂、宿主植物多样性丰富，导致内生真菌的多样性更加丰富，从而会发现更多新的真菌分类单元，这在菌种收集和保藏方面独具优势。内生真菌可使禾草提高抗逆性并适应逆境甚至极端环境条件，这对于深入探讨内生真菌－宿主之间的相互作用，有目的性和科学性地构建新的禾草内生真菌共生体及植物微生态系统的研究都具有十分重要的意义。

禾草；内生真菌；多样性

在禾草中度过全部或大部分生命周期，而外部不引起明显病害症状的一大类真菌叫禾草－内生真菌，其中，香柱菌属（Epichloë）的无性型Neotyphodium与禾草的关系最为密切而成为国内外研究的热点［1］。到19世纪70年代后期，内生真菌与禾本科植物的互利共生关系才被逐步揭示［1-3］。禾草内生真菌普遍存在并具有多样性，在天然草地和人工草地的禾草中均有广泛分布［4］。同时，自然生态系统中禾草－内生真菌的关系复杂而多变，土壤养分难以满足双方的需求，表现出从拮抗到互利的多种共生关系［5-6］。禾草生存环境的异质性及内生真菌的遗传多样性都很高，这种差异不仅与禾草和内生真菌的基因型有关，也与禾草的环境条件及内生真菌的种类有关，因此，正是这种生境的特殊性决定了禾草内生真菌的研究既有理论的广度和深度，又有多方面的应用潜力。从20世纪80年代中期起，国内外在禾草内生真菌的多样性研究中取得了一定的成就［4，7-12］。本文将简要概述这方面的研究进展。

1 内生真菌种类多样性

第18届国际植物会议上，真菌等的命名规则进行了调整。利用这一规则，Leuchtmann［13］等将与禾草共生的香烛菌属的有性型Epichloë和其无性型Neotyphodium的种类通过重新组合共形成了43个分类单元，包括种、亚种和变种，将原来命名的一些种降级为变种、亚种或作为异名归并，如：N.lolii变为E.festucae var．lolii，E.clarkii变为E.typhina subsp．clarkii，E.yangzii并入E.bromicola；原来的N.chilense和N.starrii两个种未被承认［14-31］（表1）。目前，许多带内生真菌的禾草仍有待于进一步的鉴定、分类和命名［12，25，32-35］。然而，对于Epichloëtyphina而言，仍然是较大的一个种，宿主禾草包括12个属，需要从形态、生理生化及系统发育等方面更进一步的深入研究，很可能分解为几个不同的种或种以下的分类单元。从目前的研究结果分析，平均每种宿主禾草有4～5种内生真菌，按地球目前25万种植物计算，内生真菌总数可超过100万种［36］。

近年来，我国在禾草内生真菌种的多样性研究中也成绩显著，新种不断出现。2004年Li等［20］将分离于我国甘肃醉马草（Achnatherum inebrians）的内生真菌命名为E.gansuensis（Neotyphodium gansuense）；在此基础上，2007年，美国Schardl教授实验室又将分离于我国新疆的醉马草内生真菌命名为E.gansuensis var．inebrians（N.gansuense var．inebrians）［22］；后来，南京农业大学王志伟课题组和南开大学高玉葆课题组分别在鹅观草属（Roegneria）、佛子茅属（Calamagrostis）、羊茅属（Festuca）、早熟禾属（Poa）及羽茅（A.sibiricum）上相继发现了8个种［14，18，26-28］。我国禾本科植物资源很丰富，已经检测到越来越多的禾草内生真菌共生体［11-12，34］，相信更多的内生真菌分类单元将会被发现。

2 内生真菌形态多样性

同种禾草的内生真菌分布特征及形态学特征因地理区域而异［37］；张欣等［38］从内蒙古中东部地区羽茅6个地理种群中共分离得到19株不同形态的Epichloë属真菌；Ren等［8］对内蒙古羽茅不同地理种群中分离出的484株菌株形态特征进行了分析，结果表现出较高的多样性；金文进［9］对我国甘肃、新疆、青海、内蒙古等不同地理种群、不同组织的21株E.gansuensis菌株进行形态多样性分析，结果发现这些菌株的菌落颜色、质地、生长速率、分生孢子大小、形状等都存在较大的差异。Schulthess和Faeth［39］从天然禾草亚利桑那羊茅5个地理种群的叶片中共分离得到400多株不同形态的菌株；Simpson等［40］研究发现，相同基因型的菌株随着培养时间的不同，其形态可发生可逆性的变化。导致形态多样性的原因可能是：宿主植物和内生真菌的基因型不同，环境及其基因型与环境的互作、协同进化［41-42］；或是体外分离培养条件等的差异造成菌的形态多样性。这也从另一个角度反映出：目前经典的形态学分类标准已很难准确地反映菌的分类学地位，必须建立与宿主植物内环境相似的生态模型，确保内生真菌的分离和培养，同时也应该探究从活体植物组织内直接检测和鉴定内生真菌的方法和技术。

3 宿主多样性

禾草内生真菌具有严格的宿主特异性［6，11，22，43］，因此，内生真菌的多样性很可能与宿主数有一定的关系。目前全世界至少已在80个属290多种以上禾本科植物中发现有内生真菌，温带禾草可能有10%的种类带有内生真菌，而早熟禾亚科约30%的种有Epichloë内生真菌［6，44］。全世界已报道至少有30个属的禾草带有Epichloë内生真菌［4］，我国至少在25个属的天然草地禾草中发现内生真菌［11，20，23，33-34］。同种Epichloë真菌甚至有不止一种禾草与其共生，如醉马草和羽茅均可与E.gansuensis共生。不同宿主分离到的内生真菌数量和种类不同，同一宿主不同个体分离到的内生真菌种类也有差异［45］。这可能与宿主植物本身基因型及其周围环境因子有关［46］。从目前已有的文献报道来看，同属不同种的禾草也有感染，如早熟禾、羊茅等，说明宿主的多样性不仅表现在属上，而且还表现在种上。尚未发现有性态Epichloë并产生子座的宿主种类仍然较多。

4 生境多样性

禾草内生真菌在南北半球不同的生态环境均有分布［15，22-23，47］，已报道的Epichloë种主要分布在欧洲、北美洲、亚洲、南美洲和非洲的禾本科植物中（表1）；多个Epichloë种和变种广泛分布于世界各地不同生境中［6，28，32，47］，但侵染率却呈现出丰富的多样性，有些种群在不同的生境中相当稳定，有些则变化明显［23，33-34，44，48］。这可能是：宿主植物和内生真菌之间的相容性不同、侵染种子的菌丝失活；或是由于宿主植物的空间分布、种子的传播方式不同，随着空间和时间以及环境选择压力的变化，其侵染率也会相应地发生改变［49］；或是因为真菌和植物基因之间的相互作用以及环境因素等共同造成［7］；中等侵染率的内生真菌种群可能是不稳定的，其侵染率有增加或降低的趋势，这决定于所在环境条件的选择［33，44］。调查发现，一般在干旱、半干旱的地区被内生真菌侵染的禾草种类较多、带菌率较高，且极少发现有性态Epichloë属香烛；而湿润地区则较易形成香烛。对于内生真菌与醉马草、披碱草等共生体，分布范围可从海拔1000～4000 m，带菌率可为0～100%。

5 遗传多样性

同一宿主内生真菌不同菌株所产生的次生代谢成分并不相同，这就意味着宿主与内生真菌可能进行遗传物质的交换，从而导致它们遗传性状的多样化。Epichloë属起源有3种途径［50］：直接起源于Epichloë属的某个种；Epichloë的种间杂交；Epichloë与其无性态Neotyphodium杂交。全球不同生境禾草内生真菌起源种不多，却依靠杂交重组产生了新的遗传特性，进而适应了不同的环境，产生了丰富的遗传多样性，出现了许多新的种、亚种及变种［13］。内生真菌进化的多样性加上宿主的不断进化，增强了共生体的遗传多样性［51］。

分子标记技术揭示禾草内生真菌的种数不多，但种群的遗传多样性却很丰富。Lappalinen和Ylimattila［10］利用RAPD技术研究发现，同种内生真菌往往具有多样化的遗传型；De Jong等［52］利用SSR标记评价了禾草内生真菌的遗传多样性，结果表明Epichloë菌之间的多态标记超过了85%；Saha等［53］利用SSR标记发现羊草内生真菌的多样性很丰富；Oberhofer和Leuchtmann［54］研究发现，H.europaeus是目前Epichloë菌中多样性最丰富的草种，已报到可以和Epichloë的4个种共生；分离自我国不同生态区的疯草内生真菌具有一定的遗传多样性［42］；张欣等［38］研究发现不同地理种群内生真菌菌株由于其地理分布广、气候差异大、群落类型差别也较大，从而造成不同地理种群内生真菌形态上的分化以及种群间明显的遗传分化和较高的遗传多样性；魏宇昆等［7］通过形态学和RAPD方法对4个样地所含的27个羽茅内生真菌菌株的遗传多样性进行了研究，结果表明，羽茅内生真菌在形态和基因水平上均表现出较高的遗传多样性。李伟等［11］对分离自我国的22株Epichloë菌遗传多样性分析显示：菌株间存在一定的遗传多样性；陈永敢等［12］利用RAPD标记对我国Epichloë内生真菌进行了真菌种类、宿主种类、采集地和菌株间的遗传多样性探讨，结果也表明遗传多样性很丰富，许多不同宿主的菌株独立聚类，同时不同地理，不同种类的菌株聚类也不同。

目前，美国肯塔基大学Christopher Schardl实验室已经完成E.festucae等内生真菌的测序，澳大利亚维多利亚农业生物技术中心German Spangenberg实验室已经完成var．lolii和E.coenophiala等内生真菌的序列。这将有利于进一步深入研究禾草内生真菌的功能基因多样性。

6 禾草内生真菌多样性的意义

目前，有关内生真菌的研究主要集中在分离，鉴定，人工接种及提高植物抗性方面。内生真菌有些生长很慢，而且主要生长在宿主内部组织，所以很容易被宿主表面杂菌覆盖，有的甚至不适宜在体外基本培养基上生长。另外，内生真菌产生的次生代谢物种类丰富而量很少，这就加大了其分离和鉴定等的难度。国内外关于内生真菌提高禾草抗逆性的研究结果也不尽一致［2，25］，新西兰已成功人工构建了抗逆、无毒的禾草共生体，我国尚处于试验研究阶段，但进展良好。许多研究者还提出禾草内生真菌的生物多样性可能在生物群落和生态系统水平方面具有一定的作用：具有较强抗逆性的带菌禾草能迅速占据生态位，具有更强的竞争优势［37］，导致能量的传递受到干扰，群落结构发生改变，进而影响植物群落的演替［55-57］。以上种种问题，使内生真菌的多样性研究显得尤为重要，生物多样性丰富的地区，内生真菌的多样性就更丰富，特定地区独有的禾草植物研究，发现新菌的可能性会更大，同时全球生态环境复杂，研究多样性还可以收集和保藏菌种，而且极端环境多样性的研究，很可能具有独特的生物学特性，这对于从各个层面上深入探讨内生真菌－宿主间的相互作用，了解它们和人类自身生存环境的密切关系，探究内生真菌的生物学本质及其未知的生态学作用具有重要的意义。另外，还可为植物微生态系统的研究提供更多的资料。

7 禾草内生真菌多样性的应用前景

7．1 植物生长调节剂

研究认为，内生真菌促进植物生长是因为它可以产生生长素等激素类物质。人们从体外培养的高羊茅E. coenophiala内生真菌中已分离到了IAA［58］，Latch等［59］认为黑麦草感染植株生物量的增加可能与赤霉素（GA）有关。内生真菌产生的次生代谢物很丰富，环境相容性好又不容易造成环境污染，所以将有望成为很好的植物生长调节剂的来源。

7．2 生物农药

黑麦草内生枝顶孢菌产生的活性物质过胺已证实是一种广谱昆虫拒剂、E.uncinata代谢物是一种广谱杀虫物质，从感染的早熟禾（P.am pla）分离到的黄酮类化合物对蚊子幼虫有毒性，巴布达橄榄（Bontia daphnoides）杂草内生真菌（Nodulisporium sp．）产生的一种吲哚二萜类代谢物具有杀灭大苍蝇幼虫的活性，黑麦草内生真菌产生的生物碱有抗阿根廷茎象虫（Listronotus bonariensis）的活性，有些内生真菌的代谢物具有抗病原菌、抗线虫等多种生物学活性［16，24，60-62］，这些为植物病虫害的生物防治拓宽了新思路，可以直接从内生真菌中寻找具有抗病、抗虫作用的活性化合物，或利用寻找的先导化合物来研制新的生物农药，或把具有抗病、抗虫活性的内生真菌直接接入或感染植物作为拮抗菌或增产菌而发挥生防作用，也可将内生真菌作为外源基因的载体，将某些基因导入到内生真菌中，提高植物的抗病虫能力，这些在农业上已有成功应用［63］。当然，要使这些新思路全部成功并应用于工农业生产，还有许多诸如活性代谢物产生的遗传背景、结构与毒性关系、作用机制及其作用的稳定性、持久性和针对性等复杂问题有待深入研究。

7．3 草坪草、牧草、禾谷类作物育种

内生真菌具有双重特性，所以筛选出既有抗虫性和抗逆性又对植食动物无害的内生真菌种类，是牧草育种科学家育种的新目标。早在20世纪90年代，数十种带菌的草坪草品种就已被新西兰和美国内生真菌学家与牧草育种家联合培育出，后来又利用内生真菌种类的多样性、遗传多样性、产检多样性等相继培育出优质、无毒的黑麦草以及高羊茅新品种［64-65］。新西兰科学家还育成了防治飞机场鸟击的机场绿化新品种［66］。我国人工草业正在蓬勃发展，这方面的研究才刚刚起步，尚缺乏具有自主知识产权的带菌草坪草和带菌抗逆无毒的牧草新种质、新材料和新品种。从小麦（Triticum aestivum）近源属、种入手，是各国都在积极尝试将内生真菌应用于禾谷类粮食作物育种的新思路，但还未见效。也有人计划将来源于我国天然草地的抗逆、无毒的Epichloë内生真菌菌系导入优良牧草，进而导入饲用的燕麦（Avena sativa）、大麦（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays），最终应用于粮食作物小麦，创建禾草／禾谷类作物新种质、新材料，为进一步选育粮、饲作物新品种奠定物质基础。

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Research advances on diversity of grass Epichloëendophytes

JIN Wenjin1，2，LI Chunjie2*，WANG Zhengfeng3
1.College of Chemical and Engineering，Gansu Industry College，Tianshui 741025，China；2.State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems，College of Pastoral Agriculture Science and Technology，Lanzhou University，Lanzhou 730020，China；3. Baiyin Institute of Agricultural Sciences，Baiyin 730900，China

Grass Epichloëendophyte is a microorganism community with abundant biodiversity；it has become one of the most popular research topics，because of its ecological and physiological functions and the great application potentiality in the fields of agriculture and medicine as biocontrol agents and foreign gene carrier at home and abroad．In this review，the diversity of endophytic fungi in grasses have been summarized，mainly cool-season grasses infected with these endophytes mostly belong to Clavicipitaceae genera of Epichloë（anamorph Neotyphodium）．It mainly included the diversities of fungal species，symbiotic host，habitat，morphology and genetics．Eco-environmental complex and abundant plant biodiversity lead rich diversity of endophytic fungi，and more and more new endophyte taxa should be discovered．This is more likely that has unique advantages in the collection and preservation of new fungi．Endophyte could improve the stress tolerance of host grass，make grass to be adapted under stressed even extreme environmental conditions．It has great significance to study deeply on interactions between plant and endophyte，and to build novel symbiosis and the micro-ecosystem of plants．

grass；endophytic fungus；diversity

10．11686／cyxb20150120 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

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2014-02-22；改回日期：2014-08-29

国家重点基础研究发展计划（973项目）课题（2014CB138702），国家自然科学基金项目（31372366）和兰州市科技攻关计划项目（2008-SY-12）资助。

金文进（1971-），女，甘肃天水人，副教授，硕士。E-mail：jinwenjin06＠163．com

*通讯作者Corresponding author．E-mail：chunjie＠lzu．edu．cn