木质纤维分解菌群筛选及其对秸秆分解与畜禽粪便除臭能力评价

杨巧丽，姚 拓，王得武，滚双宝*

（1．甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州730070；2．甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉744000；3．甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州730070）

木质纤维分解菌群筛选及其对秸秆分解与畜禽粪便除臭能力评价

杨巧丽1，2，姚 拓3，王得武1，滚双宝1*

（1．甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州730070；2．甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉744000；3．甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州730070）

为获得高效的木质纤维素分解菌群，并研究该菌群的分解能力及对畜禽粪便利用能力。以牛、鸡粪混合储粪池中土样为材料，利用限制性培养技术筛选了一组木质纤维素分解菌群；以未经化学处理的秸秆（小麦秸秆、稻草秸秆、玉米秸秆）为材料，利用失重法测定木质纤维素分解菌群的分解能力及抗杂菌污染能力；以自然风干的畜禽粪便为唯一营养源，初步评定了该菌群对畜禽粪便的利用能力和除臭能力。结果表明，筛选的木质纤维素分解菌群48 h将培养基内滤纸崩解成糊状，滤纸分解率达84．55%；灭菌条件下接种木质纤维素分解菌群培养6 d，小麦秸秆、稻草秸秆、玉米秸秆总重量分别减少47．00%，48．62%，50．21%，接入杂菌条件下接种木质纤维素分解菌群培养6 d，小麦秸秆、稻草秸秆、玉米秸秆总重量分别减少42．14%，44．99%，53．74%；分别以5 g的猪粪、3 g的鸡粪为唯一营养源制作100 m L粪便培养液（添加0．35%滤纸），接入木质纤维素分解菌群后，滤纸分别在第3天和第4．5天被分解成糊状，第8天粪便培养液臭味强度（微弱臭气味）较对照（强烈臭气味）明显减弱。木质纤维素分解菌群能高效降解未经化学处理的玉米秸秆等木质纤维材料，抗外来杂菌能力强，能够利用畜禽粪便快速分解纤维素，并具有一定的除臭能力，在农业废弃资源无害化处理及资源化利用等领域具有研究和开发价值。

木质纤维素分解；菌群；农业废弃资源；秸秆；畜禽粪便；除臭

我国农业有机废弃资源极其丰富，其中以畜禽粪便和秸秆所占比例最大。据统计，2006年我国畜禽粪便总产量约为32×108t［1］。我国农作物秸秆资源年产量7×108t，占世界总量的25%，其中以玉米秆、稻秆、麦秆为主，约占秸秆资源的75．6%［2-4］。由于农业废弃资源中含有大量木质纤维素等难分解物质，使得这些废弃资源在实际生产中难以有效利用，并已成为威胁我国环境安全的主要污染源。另外，畜禽粪便产生的大量恶臭气体对人畜及周边的环境造成极为不利的影响［5］，也已成为环境公害之一［6］，研究去除恶臭物质的技术，成为当前科研工作者的一项紧迫任务。

木质纤维素自身分子量大，木质素、半纤维素及纤维素相互缠结，结构复杂，性质稳定［7-9］，自然条件下极难分解。以往木质纤维素分解菌的研究多针对碱等化学方法预处理后的秸秆，如王洪媛和范丙全［10］筛选的一株扩张青霉，对2%NaOH处理后的小麦秸秆10 d分解率为56．3%。王伟东等［11］利用菌种协同理念筛选的菌群对经过NaOH预处理后的秸秆等天然木质纤维原料有极强的分解能力，其中复合系WSC-6接种3 d后对经过碱处理的稻草秸秆分解率达81．3%。李培培等［12］筛选的秸秆还原菌群ADS-3，对用1%NaOH处理的小麦（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea mays）三大农作物秸秆都有稳定高效的分解能力。刘长莉等［13］筛选的常温纤维素分解菌群能够在5 d内分解1．5%NaOH处理的水稻秸秆总重量的39．6%。虽然NaOH预处理具有脱木素和降低结晶度的作用［2］，能有效提高木质纤维材料的分解率，但需要中和及回收等工序，实际应用受到一定的限制，目前有关针对未经任何化学方法处理的天然木质纤维素材料分解利用的报道较少［3］。利用微生物除臭剂具有成本低廉、无二次污染等特点，已成为治理恶臭的一个重要研究方向，目前使用的除臭微生物菌剂主要以直接分离筛选单菌株或对分离的单菌株简单组合的方式获得。陈丽园等［14］筛选的菌株10MG能使猪粪氨气和硫化氢气体的释放量分别降低67．95%和26．6%。由于臭气成分复杂，单一微生物除臭效果有限，多种微生物共同作用往往具有更强的除臭效果。叶芬霞等［15］筛选的3株微生物经混合培养，制成复合微生物除臭剂对猪粪、鸡粪和牛粪中NH3的去除率达80%以上，H2S的去除率达65%以上。高华等［16］筛选的6株除臭菌经混合培养得到的除臭菌剂对畜禽粪便也具有较强的除臭能力。稳定的微生物系统是保证除臭效果的一个重要因素，但通过直接分离筛选单菌株或对分离的单菌株简单组合的方式得到的除臭菌剂，在功能及稳定性等方面有一定的局限性。此外，实验室条件下得到的各种高效微生物菌剂，实际应用中还受环境条件、土著菌及营养条件等因素的限制，不一定都能够达到预期目标，有些效果微乎其微，甚至是完全失败的。

本研究以牛、鸡粪混合储粪池中微生物为菌源，以微生物协同作用为出发点，通过传代与组配的方式筛选了一组木质纤维素分解菌群，以未经化学处理的秸秆为材料，研究了该菌群对木质纤维素的分解能力及抗外来杂菌污染能力，并以自然风干的畜禽粪便为唯一营养源，初步探讨了该菌群对畜禽粪便的利用能力及除臭能力，以期为其在秸秆还田、堆肥、沼气原料预处理及畜禽粪便除臭等领域的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 菌种来源 土样采自甘肃农业大学动物养殖场连续使用8 a的牛、鸡粪混合储粪池。

1．1．2 培养基［16-17］蛋白胨5 g，酵母膏5 g，纤维素（新华滤纸）5 g，NaCl 5 g，CaCO32 g，K2HPO41 g，MgSO4·7 H2O 0．5 g，FeSO4·7 H2O 0．5 mg，MnSO4·H2O 0．16 mg，ZnSO4·7 H2O 0．16 mg，CoCl20．2 mg，加蒸馏水至1000 m L，p H 7．0，121℃灭菌25 min。

1．1．3 纤维材料 滤纸使用前以1%醋酸浸泡过夜，用蒸馏水冲洗至中性，80℃烘干备用。小麦秸秆、稻草秸秆和玉米秸秆粉碎过1 mm筛，80℃烘至恒重，备用。

1．1．4 杂菌溶液 取800 m L蒸馏水，加入100 g堆肥原料、100 m L生活废水和5 g NaCl，150 r／min振荡30 min，静止30 min后取上清液，即杂菌溶液。

1．1．5 粪便来源 猪粪采自甘肃省兰州猪场粪池（100日龄长大二元杂交系肥育猪粪便），鸡粪采自甘肃农业大学动物养殖场粪池（40日龄AA肉仔鸡粪便），自然风干，备用。

1．2 木质纤维素分解菌群的筛选

于2012年9月—2013年1月，从储粪池不同采样点（4个）各取土样5 g，分别接入100 m L培养基内培养（每组设6个重复），命名为第1代，待培养液中滤纸分解至不再明显变化，取其菌液5 m L接入新鲜培养基（见1．1．2），命名为第2代，重复接种，依次为3，4，……，n代。培养条件：28～34℃，80 r／min微振，微厌氧。根据滤纸条的断裂程度初步判断各组初筛菌群的降解效果：＋滤纸边缘膨胀；＋＋为滤纸边缘不定形；＋＋＋滤纸整体不定形；＋＋＋＋滤纸成团糊状；＋＋＋＋＋滤纸完全成糊状。

对筛选得到的木质纤维素分解菌群培养2 d，测定滤纸的失重量（分解量），计算失重率（分解率），具体方法如下：参考测定饲料粗纤维使用的尼龙袋技术［18］及测定土壤纤维分解强度使用的尼龙网袋法［19］，利用38μm尼龙袋过滤培养基，再用蒸馏水冲洗，80℃烘干至恒重，计算。纤维材料分解率＝（纤维材料原质量＋滤袋质量－烘干后纤维材料与滤袋质量和）／纤维材料原质量×100%。

1．3 木质纤维素分解菌群对秸秆分解能力的测定

1．3．1 灭菌条件下木质纤维素分解菌群对秸秆分解能力的测定 分别称取小麦秸秆、稻草秸秆、玉米秸秆1 g为培养基唯一碳源制作100 m L培养基，接入5 m L杂菌溶液，灭菌后接入5 m L木质纤维素分解菌群，培养条件同1．2，分别在第3，6，9和12天测定不同纤维材料的失重量（分解量），计算失重率（分解率），测定方法同1．2。

1．3．2 接入杂菌条件下木质纤维素分解菌群对秸秆分解能力的测定 分别称取小麦秸秆粉、稻草秸秆粉、玉米秸秆粉1 g为培养基唯一碳源制作100 m L培养基，接入5 m L杂菌溶液和5 m L木质纤维素分解菌群，整个过程不做任何加热及灭菌处理，培养及测定方法同1．3．1。

1．4 木质纤维素分解菌群对畜禽粪便利用能力及除臭能力的评定

取猪粪2．5，5．0，7．5 g，鸡粪1．5，3．0，4．5 g，分别添加0．35 g滤纸（调节反应体系碳氮比；其形状变化能够直观的反映木质纤维素分解菌群对纤维素的分解能力，从而评定该菌群对畜禽粪便的利用能力），加蒸馏水至100 m L（即为粪便培养液），分别接入5 m L木质纤维素分解菌群（粪便培养液中接入5 m L灭活的木质纤维素分解菌群作为对照），进行培养，培养条件同1．2，期间每隔12 h观察一次滤纸的分解效果。

培养8 d后，打开培养液封口膜，由嗅辨小组（10名研究生组成，均无吸烟或嗅觉障碍，5女5男，年龄在20～27岁之间）对滤纸分解速度最快的组别及相应的对照进行臭味强度评定（评定时掩盖样品的标签，使测定者不知道哪个是实验组哪个是对照组，以消除心理影响），评定按6个等级进行：无臭味；勉强感觉到臭味；微弱臭气味；明显臭气味；强烈臭气味；难以忍受的臭气味。

1．5 数据分析

采用Microsoft Excel 2003软件对数据进行处理和绘图，采用SPSS 18．0统计分析软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2．1 木质纤维素分解菌群的筛选

从储粪池不同采样点采集的土样，初筛得到4组菌群（表1）。培养过程中发现，菌群X1第1代分解速度最快，240 h将滤纸分解成糊状，此后随着培养代数的增加，滤纸分解成糊所需时间迅速缩短，第7代48 h左右可将滤纸分解成糊状（菌群X2和菌群X3呈类似趋势）。培养至第13代发现菌群X2的滤纸分解能力出现较严重的退化，第20代以后，菌群X1和菌群X3的滤纸分解能力也出现了不同程度的退化，推断可能是由于传代过程中丢失一些菌种，或菌群分泌的代谢产物积累过多所致。整个筛选过程，菌群X4对滤纸分解能力较差（滤纸变软、边缘崩解迹象，但始终不能彻底分解滤纸）。

取4组初筛菌群第15代时的菌液等比例混合接入新鲜培养基，进行培养，得到新的菌群（命为第16代），并继续传代培养24代，期间淘汰分解能力差、衰退严重及分解能力不稳定的菌群。前后共计40代传代培养，最终获得了一组高效、稳定的菌群，由图1可以看出，该菌群在组配初期（第16代），对滤纸的分解能力极强，36 h可将滤纸分解为糊状，传代中后期对滤纸分解能力逐渐稳定，48 h能将滤纸分解呈糊状，此时测得滤纸分解率达84．55%。

2．2 木质纤维素分解菌群对秸秆的分解能力

2．2．1 灭菌条件下木质纤维素分解菌群对秸秆的分解能力 灭菌条件下，接入木质纤维素分解菌群培养3 d，3种秸秆的分解率达40%左右，此后随着培养时间的延长，分解速度及相对分解量迅速下降，表明旺盛分解主要集中在前3 d。木质纤维素分解菌群12 d内对3种秸秆的分解率均高于52%，对玉米秸秆的分解率高达58．06%，显著高于对小麦秸秆和稻草秸秆的分解率（表2）。

2．2．2 接入杂菌条件下木质纤维素分解菌群对秸秆的分解能力 培养基蛋白胨和酵母膏含量较高，营养条件良好，接入杂菌且不做加热及灭菌处理的条件下，杂菌大量生长。尤其在发酵前期，木质纤维素分解菌群需要快速增殖，是降解反应得以维持的关键阶段，体系内菌间竞争激烈，木质纤维素分解菌群3 d内对小麦秸秆、稻草秸秆和玉米秸秆的分解率分别为36．02%，41．41%和44．44%，表明木质纤维素分解菌群在大量杂菌存在的条件下具有竞争优势。随着培养时间的延长，分解强度逐渐降低，分解速度及相对分解量呈迅速下降趋势，12 d内对3种秸秆的分解率均高于46%，对玉米秸秆的分解率高达56．79%（表3）。

由表2和表3可知，灭菌条件下与接入杂菌条件下分别接种木质纤维素分解菌群后，3种秸秆的分解量及分解率变化趋势相近：前3 d分解强度最高，随培养时间延长，分解强度呈下降趋势。培养前期（0～3 d），木质纤维素分解菌群在接入杂菌条件下对稻草秸秆和玉米秸秆的分解强度高于灭菌条件下的水平；培养中后期（9～12 d），木质纤维素分解菌群对3种秸秆在灭菌条件下的分解强度高于接入杂菌条件下的水平，表明外来杂菌不一定对木质纤维素分解菌群的分解性能起抑制作用，也表明木质纤维素分解菌群的组成菌种间及菌群与外来杂菌间作用机理极为复杂。

2．3 木质纤维素分解菌群对畜禽粪便的利用能力及除臭能力

木质纤维素分解菌群的营养完全由畜禽粪便提供，滤纸的分解效果能够较直观反映木质纤维素分解菌的活性及对畜禽粪便的利用能力。由表4可知，猪粪添加量为5%时，滤纸在第3天分解呈糊状；鸡粪添加量为3%时，滤纸在第4．5天分解呈糊状，不同粪便添加量下对照组的滤纸在第8天时边缘膨胀或呈不定形，但始终未被完全分解，表明木质纤维素能够利用畜禽粪便的营养成分高效分解纤维素。自然风干的粪便中还带有大量的土著微生物，滤纸能够快速被分解，表明木质纤维素分解菌群在大量土著菌存在的条件下仍具有竞争优势。

第8天由10名嗅辨人员对猪粪添加量为5．0%，鸡粪添加量为3．0%的粪便培养液及其相应的对照进行臭味强度评定。统计结果见表5，接入木质纤维素分解菌群的培养液臭味强度（微弱臭气味）较对照（强烈臭气味）明显减弱，表明木质纤维素分解菌群对畜禽粪便有一定的除臭作用。

3 讨论

3．1 木质纤维素分解菌群的筛选

本研究通过长期传代与组配相结合的方式，筛选优势菌种，提高其菌间协同作用。以该方式获得的木质纤维素分解菌群本身就是一个微生态系统，菌群内微生物个体之间协同作用强，功能稳定、抗外界的干扰能力强，具有纯培养的微生物无法比拟的优势［12］。

3．2 木质纤维素分解菌群对秸秆的分解能力

灭菌条件下和接入杂菌条件下，木质纤维素分解菌群对小麦秸秆、稻草秸秆、玉米秸秆3 d分解率分别达37．53%，39．51%，42．80%和36．02%，41．41%，44．44%。与王洪媛和范丙全［10］筛选的单菌株以及王慧等［3］筛选的复合系XDC-2，王伟东等［11］筛选的复合系WSC-6，李培培等［12］筛选的复合系ADS-3和刘长莉等［13］筛选的纤维素菌群复合系相比，本研究筛选的菌群具有反应温度适中、反应底物无需化学处理、前期秸秆分解速度快、抗杂菌污染能力强等优势。

小麦秸秆、稻草秸秆和玉米秸秆均属天然高有机分子材料，其化学组成不同，木质纤维素分解菌群对其分解强度有差异，3种秸秆的分解率次序为玉米秸秆＞稻草秸秆＞小麦秸秆，玉米秸秆在培养中后期（3～12 d）的分解量及分解率均高于小麦秸秆及稻草秸秆，推断木质纤维素分解菌群的该特性可能与菌源采集环境有关：储粪池中碳源主要以动物（牛）过腹的玉米秸秆为主，长期在该条件下生长的木质纤维素分解菌可能对玉米秸秆有较强的分解能力。

3．3 木质纤维素分解菌群对畜禽粪便的利用能力及除臭能力

长期堆放牛粪、鸡粪的混合储粪池含有大量的木质纤维、粗蛋白及微生物所需的各种元素，木质纤维素分解菌富集，这也是本研究所筛菌群菌株组成多样性及菌群高效性的基础。由于木质纤维素菌群菌源来自牛、鸡粪混合储粪池，推断该菌群对畜禽粪便微环境可能有较好利用及适应能力。经研究发现，木质纤维素分解菌群利用培养液中粪便（猪粪、鸡粪）作为营养源，3．0～4．5 d能将培养液中滤纸分解成糊状，说明该菌群能够利用粪便中的营养成分高效分解纤维素，同时也说明该菌群对粪便环境具有较好的适应和利用能力，期间粪便中的木质纤维素可能也有一部分被分解，但具体分解量还有待于进一步测定。此外，自然风干的畜禽粪便中有大量的土著微生物（包括畜禽胃肠道微生物［20］及通过空气和人工操作传播至粪便中的微生物），该条件下木质纤维素分解菌群能够利用畜禽粪便高效分解纤维素，进一步证明木质纤维素分解菌群功能的稳定性。

畜禽粪便臭气是许多单一臭气物质复杂相互作用的产物，其成分主要包括挥发性脂肪酸（VFA）、酸类（Acids）、醇类（Alcohls）、酚类（Phenols）、醛类（Aldehydes）、酮类（Ketones）、酯类（Esters）、胺类（Amines）、硫醇类（Mercaptans）及含氮杂环化合物等［21-22］。研究表明，猪粪产生的气体超过168种，而且其中的大部分与臭味相关［5，23-24］，很难根据一种或数种主要成分来准确地描述畜禽粪便臭气的质和量［6］。嗅觉虽然不能对臭气组分质化和量化评定，但其具有操作简单和综合性强的优点。本研究对臭气未作稀释处理，利用嗅觉初步评定了木质纤维素分解菌群除臭能力，结果发现实验组较对照组臭气强度降低了近两个等级（臭味从强烈到微弱），说明木质纤维素分解菌群对猪粪、鸡粪臭气中部分恶臭组分具有极强的去除能力（畜禽粪便产生的恶臭物质具备特异性，稀释几百倍后，即使浓度很低但气味显著［6］。可见木质纤维素分解菌群在畜禽粪便除臭领域具有研究与开发潜力，但其除臭效果还有待于进一步质化和量化测定。

畜禽粪便产生的臭气组成复杂，种类多样，仅依靠一种或几种微生物很难达到理想的去除效果。在实际生产中，微生物除臭菌剂只有成为优势菌后才能发挥其作用，因此稳定的微生物系统是保证除臭效果的一个重要因素。本研究以长期堆放牛粪、鸡粪的储粪池中的微生物为菌源，利用传代培养的方式，得到的木质纤维素分解菌群功能稳定，菌间协同作用强，更有利于除臭作用的发挥，这对现阶段除臭微生物筛选方法的改进具有一定的参考价值。

3．4 研究展望

微生物菌剂功能的稳定性、抵抗外来杂菌污染能力、对特定环境的适应性及可利用营养物质的经济适用性等特征是评价其利用价值的重要指标。本研究筛选的木质纤维素分解菌群能够高效降解未经化学处理的玉米秸秆等天然木质纤维原料，其功能稳定、抗逆性强，在杂菌数量及种类丰富的条件下具有竞争优势，并能有效的利用自然风干的畜禽粪便分解纤维素，同时还对畜禽粪便具有一定的除臭能力。因此，在堆肥、秸秆还田、沼气原料预处理、秸秆类粗饲料加工、规模化养殖场废水处理及发酵床菌种制备等领域具有较高的研究与开发价值。

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Screening of lignocellulose degrading microbial communities for their ability to deodorize livestock and poultry wastes

YANG Qiaoli1，2，YAO Tuo3，WANG Dewu1，GUN Shuangbao1*
1.College of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Animal Husbandry and Veterinary Institute of Gansu Province，Pingliang 744000，China；3.Pratacultural College，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China

This study aimed to screen microbial communities that can efficiently decompose lignocellulose，as well as determine their ability to deodorize odor of livestock waste．Composted cattle and chicken feces samples were used to cultivate lignocellulose degrading microbial communities based on a restrictive culture technique．These microbes were mixed with unprocessed straws（wheat，rice and corn）．Subsequently，weight loss was used to evaluate the capability of the microbes to decompose lignocellulose and resist microbial contamination．Naturally dried livestock wastes were also used to investigate the ability of these microbes to utilize and deodorize livestock and poultry wastes．Six days after inoculating with lignocellulose microbial communities，weight loss of wheat，rice and corn straw reached 47．00%，48．62%and 50．21%，respectively．In contrast，the weight loss of these straws was 42．14%，44．99%，and 53．74%for wheat，rice and corn respectively in the absence of inoculation．Lignocellulose microbial communities cultivated in excrement nutrient solutions（100 m L）（containing 5 g of swine manure，or 3 g of chicken manure，or 0．35%filter paper）were able to reduce odor intensity after 8 days．In conclusion，lignocellulose microbial communities screened in this study efficiently decomposed cellulose in different straws without chemical pretreatment and were able to resist other bacteria．They were also able to deodorize odor from livestock and poultry wastes．

lignocellulose degradation；microbial community；agricultural waste resources；straw；animal excrement；deodorization

10．11686／cyxb20150124 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

杨巧丽，姚拓，王得武，滚双宝．木质纤维分解菌群筛选及其对秸秆分解与畜禽粪便除臭能力评价．草业学报，2015，24（1）：196-203．

Yang Q L，Yao T，Wang D W，Gun S B．Screening of lignocellulose degrading microbial communities for their ability to deodorize livestock and poultry wastes．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（1）：196-203．

2013-12-23；改回日期：2014-04-21

“十二五”农村领域国家科技计划课题（No．2012BAD14B10-5），甘肃省农业科技创新项目（No．GNCX-2012-45）和甘肃省科技创新项目（GMCX-2009-13）资助。

杨巧丽（1987-），女，甘肃华池人，研究实习员。E-mail：yangql0112＠163．com

*通讯作者Corresponding author．E-mail：gunsb＠gsau．edu．cn