多年生黑麦草愈伤组织航天搭载后再生株系的抗旱性研究

彭丽梅，曹 丽，韩 蕾，钱永强，孙振元*

（1．中国林业科学研究院林业研究所，国家林业局林木培育重点实验室，北京100091；2．棕榈园林股份有限公司，上海200433；3．延边大学农学院，吉林延吉133002）

多年生黑麦草愈伤组织航天搭载后再生株系的抗旱性研究

彭丽梅1，2，曹 丽1，3，韩 蕾1，钱永强1，孙振元1*

（1．中国林业科学研究院林业研究所，国家林业局林木培育重点实验室，北京100091；2．棕榈园林股份有限公司，上海200433；3．延边大学农学院，吉林延吉133002）

利用“神舟七号”飞船搭载多年生黑麦草品种（Derby）的胚性愈伤组织经空间诱变后，从搭载再生株系（SP）群体中获得了3个抗旱变异株系。自然干旱条件下，对筛选出的3个抗旱变异株系进行了生理生化分析，结果表明，随自然干旱时间的延长，3个抗旱变异株系均表现出叶片相对含水量和叶绿素含量下降、SOD活性先升后降、丙二醛含量及游离脯氨酸含量上升等特征；不同株系间各指标的变化幅度存在差异，通过上述5项指标综合评价后初步认为，3个抗旱变异株系的抗旱性顺序为SP-64＞SP-119＞SP-17，与表征永久萎蔫系数反映的结果一致，表明筛选出的抗旱变异株系具有抗旱生理基础。以上结果说明，空间诱变能诱发多年生黑麦草抗旱性的变异；获得的抗旱变异株系为选育抗旱草坪草品种提供了新的种质资源。

多年生黑麦草；空间诱变；胚性愈伤组织；抗旱性

多年生黑麦草（Lolium perenne）是一种重要的冷季型草坪草种，具有早期生长快、分蘖能力强、适应土壤范围广等优点，广泛应用于园林绿化草坪和运动场草坪的建植［1-2］。但在我国大多数地区夏季干旱缺水，导致多年生黑麦草草坪使用寿命短、草坪质量差［3-4］，因此选育抗旱性强的多年生黑麦草新品种意义重大。

植物空间诱变育种技术是近年来迅速发展起来的集航天技术、生物技术与农业育种技术相结合的新兴育种技术，可以加速作物新种质资源的创造和优良品种的选育［5-6］。近年来，关于空间诱变对草类植物抗旱性的影响已有一些报道，但多集中在牧草上，有关草坪草经空间诱变后抗旱性的变异研究报道较少。1994年兰州大学用卫星搭载了红豆草（Onobrychis viciaefolia），返地后，对其田间生长情况、发芽率、耐盐、耐旱及同工酶等几个方面作了初步的研究，发现空间条件对红豆草的第2代发芽率没有明显影响，但是空间后代却具有一定的抗盐性，对PEG水分胁迫也表现一定的抗性［7］。胡向敏［8］利用“实践八号”卫星搭载冰草（Agropyron cristatum）‘蒙农杂种’干种子，发现空间环境处理的蒙农杂种冰草抗旱性略有增强的趋势。王旭等［9］利用卫星搭载技术对甘草（Glycyrrhiza uralensis）种子进行太空诱变处理，考察了卫星搭载后甘草种子在干旱胁迫条件下，萌发过程中的发芽率、胚根长势、可溶性蛋白变化以及过氧化物酶和过氧化氢酶的活力，结果表明甘草种子的抗旱性增强：在干旱胁迫条件下，飞行组种子的发芽率、胚根长势要高于地面对照组，其萌发过程中的过氧化物酶、过氧化氢酶活力也高于地面对照组。

本研究将来自1粒种子的多年生黑麦草品种（Derby）的胚性愈伤组织进行航天搭载［10］，测定了3个抗旱多年生黑麦草变异株系叶片相对含水量、叶绿素含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性及游离脯氨酸含量等生理生化指标的变化，以期为草坪草空间诱变抗旱变异研究提供参考，也为多年生黑麦草抗旱品种的选育提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 材料

试验于2010年7月至2011年3月在中国林业科学研究院科研温室内进行。以来自1粒种子的多年生黑麦草品种德比（Derby）的胚性愈伤组织通过“神舟七号”飞船搭载后，经地面组培再生的株系（SP）为试验材料。通过测定再生株系的表征永久萎蔫系数（APWI），筛选出3个抗旱多年生黑麦草变异株系：SP-64（APWI：10．39%）、SP-119（APWI：10．77%）、SP-17（APWI：10．86%）。

1．2 方法

1．2．1 抗旱变异株系的筛选 2010年7月将216株SP进行分株繁殖，种植于装有土壤基质（园土∶河沙＝3∶2）的口径16 cm、高14 cm的塑料花盆中，每盆中基质量基本一致，放置于温室自然光照下生长，进行正常养护。

采用表征永久萎蔫系数法测定植株的抗旱性，标准为：将多年生黑麦草植株叶片85%以上萎蔫且过夜不恢复时记为表征永久萎蔫，此时的土壤含水量计为APWI，APWI越高，抗旱性越弱；反之，则越强［11］。

2010年10月，待各材料盖度达到85%以上，给各份材料充分浇水至土壤最大持水量后进行自然干旱处理（不浇水）至表征永久萎蔫，每株系设3次重复。每盆随机选择4个点，共12个点，用SU-LA型土壤水分测试仪（北京盟创）测出该株系表层土壤5 cm的含水量，12个点的平均值即为该株系的APWI。

1．2．2 抗旱变异株系对自然干旱的生理响应 2010年12月28日将筛选出的3个抗旱多年生黑麦草变异株系（SP-64、SP-119、SP-17）进行分株，每盆分株15株，栽植到直径16 cm、高14 cm的塑料花盆中，底部有圆孔以排水；栽培基质为沙壤土，放置于温室中进行正常养护。

2011年2月22日筛选生长健壮而一致的株系，给各份材料充分浇水至土壤最大持水量后进行自然干旱处理（不浇水），分别设0，3，6，9 d干旱处理和第12天的复水处理，每处理设3次重复。分别于第0，3，6，9，12天对处理的株系进行取样并测定土壤含水量，取样时间为早晨8：00－9：00。叶片相对含水量（RWC）采用饱和称重法测定，叶绿素（Chl）含量采用丙酮浸提法测定，SOD活性采用NBT光还原法测定，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法测定，游离脯氨酸（Pro）含量采用酸性茚三酮法测定，均参照《植物生理学实验指导》［12］进行，各指标测定值以单位干重计。土壤含水量的测定：用SU-LA型土壤水分测试仪测出株系表层土壤5 cm的土壤含水量，每盆随机选择3个点，3次重复共9个点，求平均值。

1．3 数据处理

采用SPSS 13．0统计软件对自然干旱下抗旱变异株系的各生理指标进行方差分析。

2 结果与分析

2．1 抗旱变异株系的筛选

土壤水分测试仪测得SP的APWI平均值为12．28%，标准差为0．66%，变异范围为10．39%～14．52%，变异系数为5．42%；SP的APWI的区间估计为［10．99%，13．57%］（置信度为95%）。对216个SP的APWI进行方差分析并多重比较，结果显示SP群体内存在极显著差异（P＜0．01）。以SP群体APWI区间下限估计的临界值作为候选变异株系的筛选标准，从SP中筛选出了3个抗旱变异株系，变异率为1．39%。抗旱变异株系为SP-64（10．39%），SP-119（10．77%），SP-17（10．86%）。

2．2 自然干旱对抗旱变异株系土壤含水量的影响

分别在不同处理时期测定土壤含水量，如图1所示，随着自然干旱时间的延长，3个抗旱多年生黑麦草变异株系土壤含水量呈降低趋势。以干旱处理第0，3，6，9天的平均土壤含水量进行方差分析表明，干旱处理第0，3，6，9天，平均土壤含水量依次为34．42%±0．67%，23．93%±0．45%，16．84%±0．31%，7．93%±0．79%，土壤含水量各梯度间差异极显著（P＜0．01），说明不浇水后，土壤干旱程度逐渐加剧，对供试的多年生黑麦草材料会产生干旱胁迫，且干旱处理0～3 d土壤水分散失迅速，3～9 d水分散失较慢且速度较稳定，但同一取样时间3个多年生黑麦草株系间土壤含水量差异不显著（P＞0．05）。

2．3 自然干旱对抗旱变异株系叶片相对含水量的影响

在干旱胁迫下，植物叶片相对含水量的高低在一定程度上可以反映叶片保水能力的强弱，是衡量植物抗旱能力的一个主要指标［13］。由图2可知，3个抗旱多年生黑麦草变异株系叶片相对含水量随着自然干旱时间的延长逐渐下降，至自然干旱第6天，达到极显著水平（P＜0．01），自然干旱第9天，SP-64、SP-119和SP-17叶片相对含水量与第0天相比分别下降了38．11%，57．43%，70．51%，SP-64叶片相对含水量显著高于SP-119和SP-17（P＜0．05）。表明自然干旱处理下，SP-64叶片保水能力最强，SP-119次之，这与表征永久萎蔫系数表示的抗旱性一致。复水第3天，3个变异株系叶片相对含水量均恢复到处理前水平，说明在干旱胁迫下，3个抗旱多年生黑麦草变异株系组织或细胞受损较轻，复水后能较快恢复。

2．4 自然干旱对抗旱变异株系叶绿素含量的影响

如图3A所示，随自然干旱处理时间的延长，SP-17叶绿素总含量呈下降趋势，SP-64与SP-119呈“先升后降”的趋势。自然干旱第9天，与第0天相比较，3个多年生黑麦草株系叶绿素总含量均显著下降（P＜0．05），下降幅度为SP-17＞SP-119＞SP-64，其叶绿素总含量分别下降了34．50%，17．42%，11．41%。

由图3B可知，随自然干旱时间的加长，3个多年生黑麦草株系叶绿素a含量呈“先升后降”的趋势。处理0～3 d，多年生黑麦草叶绿素a含量增加，增加幅度为SP-64＞SP-119＞SP-17，其叶绿素a含量分别增加了6．04%，3．07%，0．30%，说明适度干旱有利于提高多年生黑麦草叶绿素a含量；处理第9天，各株系叶绿素a含量显著下降（P＜0．05），与第0天相比，SP-64叶绿素a含量下降幅度最小，SP-119次之，SP-64、SP-119、SP-17分别下降了21．36%，29．32%，49．28%。

从图3C可以看出，随着干旱时间的延长，各株系叶绿素a／b值呈“先升后降”的趋势。自然干旱0～6 d，叶绿素a／b值未出现显著变化（P＞0．05），至第9天，各株系叶绿素a／b值显著下降（P＜0．05），其中SP-17下降幅度最大。复水第3天，叶绿素a／b值增大，其中SP-17增幅最大，3个抗旱多年生黑麦草变异株系叶绿素a／b值增至同一水平。

2．5 自然干旱对抗旱变异株系SOD活性的影响

由图4可看出，随着自然干旱时间的延长，3个多年生黑麦草株系SOD活性先略上升后下降。自然干旱初期，3个多年生黑麦草株系叶片的SOD活性均有不同程度的提高，3个株系均在处理第3天时SOD活性增至最大。在自然干旱第3～6天，各株系叶片SOD活性均维持在较高水平。随着自然干旱时间的延长，活性氧积累超过保护酶系统的清除能力，并对抗氧化酶系统造成伤害，导致SOD活性下降，3个抗旱变异株系SOD活性均呈现不断下降趋势，至自然干旱第9天各株系SOD活性均显著下降（P＜0．05），下降幅度最大的是SP-17（43．73%），最小的是SP-64（23．70%），SP-119的下降幅度为34．12%。复水第3天，各株系SOD活性均大幅上升。总体来看，在自然干旱下，SP-17叶内SOD活性的变化幅度较其他株系明显，对于胁迫的敏感程度较强，在一定程度上说明其抗旱性不如其余两个株系。

2．6 自然干旱对抗旱变异株系MDA含量的影响

随自然干旱时间的延长，干旱胁迫程度加重，3个多年生黑麦草株系叶片MDA含量均增加，且三者的趋势相同（图5）。自然干旱处理第3天，测得SP-64、SP-119和SP-17叶片MDA的上升幅度分别为17．2%，12．9%和29．3%。在处理第6天测得3个株系MDA含量的增加幅度均减缓，至处理第9天，植物受伤害程度继续增大，各株系叶片MDA含量显著增加（P＜0．05），SP-64、SP-119和SP-17叶片MDA含量与第0天相比，上升幅度分别为39．15%，42．48%和68．66%。复水后3个多年生黑麦草株系叶片的MDA含量均明显降低，均恢复到处理前（第0天）的水平。从MDA含量看，3个多年生黑麦草株系抗旱性为SP-64＞SP-119＞SP-17，与表征永久萎蔫系数反映的结果一致。

2．7 自然干旱对抗旱变异株系游离脯氨酸含量的影响

干旱胁迫能够刺激植物体内游离脯氨酸的积累［14-15］。由图6可看出，随着自然干旱时间的延长，3个多年生黑麦草株系脯氨酸含量增加，除自然干旱第3天的游离脯氨酸含量与第0天不存在显著差异（P＞0．05），其他处理时期的游离脯氨酸含量分别与第0天差异显著（P＜0．05）。自然干旱第6天，3个抗旱变异株系叶片游离脯氨酸含量显著升高（P＜0．05）；自然干旱第9天各株系的游离脯氨酸含量达到最大值，SP-64、SP-119、SP-17叶片游离脯氨酸含量分别为4．32，6．62和7．13 mg／g。复水第3天各株系叶片游离脯氨酸均有一定的下降，但只有SP-64恢复到处理前水平。从脯氨酸随干旱胁迫加重的积累和复水后的恢复情况来看，SP-64脯氨酸增加量最小，恢复也快，说明其忍受干旱胁迫的能力强于其余两个株系，而且复水后能快速恢复到处理前水平。因此SP-64的抗旱性强于其余两个株系。

3 讨论

本文采用表征永久萎蔫系数作为衡量多年生黑麦草抗旱性的指标，以表征永久萎蔫系数的95%置信区间下限为临界筛选标准，从多年生黑麦草愈伤组织航天搭载后经植株再生获得的216个株系中筛选出3个具有潜在抗旱能力的变异株系。表征永久萎蔫系数法是通过测定草坪草的坪用质量为0时的土壤含水量，来评价草坪草的抗旱性：草坪草在表征永久萎蔫时土壤含水量越高，抗旱性越差；反之，则越强［11］。这种方法具有操作简单、直观且重现性好，在大规模草坪草抗旱性鉴定中比较实用。

在干旱胁迫下，抗旱能力较强的植物能维持较高的RWC［16］。本试验结果表明，在自然干旱处理下，随着土壤含水量的下降，3个抗旱多年生黑麦草变异株系叶片相对含水量均逐渐下降，初步断定，SP-64的耐旱时间最长，其次为SP-119，再次为SP-17。

干旱胁迫条件下植物体叶绿素含量的变化，会直接影响光合产量，可以指示植物对干旱胁迫的敏感度［17］。试验结果表明，随着自然干旱时间的延长，3个株系叶片叶绿素总量、叶绿素a含量、叶绿素a／b值均先升后降，说明适度干旱有利于提高多年生黑麦草株系的叶绿素含量。自然干旱第9天，3个多年生黑麦草株系叶绿素总含量和叶绿素a含量均显著下降，下降幅度均为SP-17＞SP-119＞SP-64，说明SP-64的受害最轻。干旱胁迫下叶绿素含量下降的原因可能是胁迫加速了叶绿体的降解和抑制了叶绿素的合成。Fang等［18］和Snatos［19］认为叶绿体降解的主要原因可能是胁迫下叶绿素合成酶活性下降引起的。复水后第3天，多年生黑麦草叶绿素总含量继续下降，但下降趋势减缓，表明干旱9 d后，3个多年生黑麦草株系叶绿体受害严重，3 d不足以恢复，而赵玲等［17］在干旱胁迫对草地早熟禾（Poa pratensis）抗旱生理的影响的研究中发现，复水后叶绿素含量有一定程度的恢复。复水第3天，除SP-64继续下降外，其余两株系叶绿素a均有一定程度的升高，说明叶绿素a含量的变化对干旱胁迫的响应有一定的滞后现象。

SOD是植物体内清除活性氧的第一道防线，对抵御活性氧自由基的毒害具有重要作用［20］，酶活性越高，清除自由基的能力就越强，植物的抗逆性也越强［13］。本试验表明，随着自然干旱时间的延长，3个抗旱多年生黑麦草变异株系SOD活性先升后降，这与孙宗玖等［21］在偃麦草（Elytrigia repens）、周兴元等［20］在4种暖季型草坪草上的研究结果一致，说明供试的多年生黑麦草在清除活性氧方面存在一个阈值，在这个阈值之内植物能有效清除自由基的毒害，当超过这个阈值时，保护酶活性下降，植物就会受到伤害。复水第3天，3个株系SOD活性显著上升，说明3个抗旱变异株系抗氧化酶系统均具有较强的恢复能力。

干旱胁迫下，植物体内活性氧产生和清除的代谢平衡会遭受破坏，植物细胞内大量富集活性氧，引发膜脂过氧化自由基链式反应，导致膜脂过氧化产物（如MDA）增加，膜的完整性与生理功能受到破坏［22］。MDA含量通常作为膜脂过氧化指标，常用来表示细胞膜脂过氧化程度和对逆境反应的强弱：在干旱胁迫过程中，在胁迫强度较轻，胁迫时间较短时，植物体中MDA的含量较低，质膜相对透性增加较少；在胁迫强度较重，胁迫时间较长时，MDA含量增加，质膜透性增加［16］。试验结果表明，从整个干旱进程来看，3个株系均具有很强的耐旱适应能力。

游离脯氨酸是植物细胞重要的渗透调节物质之一，干旱胁迫能刺激其在植物体内的积累，但关于其积累的量与抗旱性之间的关系，不同的植物研究有不同的结论。卢少云等［23］的研究认为耐旱性弱的地毯草（Axonopus compressus）中脯氨酸的积累对干旱更敏感，积累的量更大，且脯氨酸的积累与植物受伤害程度呈显著正相关。任文伟等［24］的研究表明，干旱胁迫下脯氨酸积累具有种间差异，并与抗旱性呈正相关。也有研究认为将游离脯氨酸积累量作为植物抗旱性的度量有一定的局限性，但将其作为某些植物在干旱胁迫下体内发生反应的一个比较敏感的参数或指标还是比较合适的［25］。本试验结果表明，3个多年生黑麦草株系游离脯氨酸含量均随着自然干旱时间的延长而不断积累，故对这3个多年生黑麦草株系而言，脯氨酸积累量更宜作为干旱伤害程度的应答指标。

4 结论

根据以上各项试验结果可知，3个抗旱变异株系在自然干旱处理下，随干旱时间的延长，3个抗旱变异株系都表现出叶片相对含水量和叶绿素含量下降、SOD活性先升后降、丙二醛含量及游离脯氨酸含量上升等特征；不同株系间各指标的变化幅度存在差异，通过上述5项指标综合评价后初步认为，3个抗旱变异株系的抗旱性顺序为SP-64＞SP-119＞SP-17，与表征永久萎蔫系数反映的结果一致，表明筛选出的抗旱变异株系具有一定的抗旱生理基础。

本研究通过空间诱变处理以诱导多年生黑麦草胚性愈伤组织发生变异，从再生植株中筛选出3个抗旱变异株系，抗旱性生理测定表明筛选出的抗旱变异株系具有抗旱生理基础，同时发现游离脯氨酸的积累是多年生黑麦草抵御干旱胁迫的生理适应性反应，可以指示受害的程度。前期的研究工作中我们还发现空间诱变能诱发多年生黑麦草的形态变异，说明空间诱变育种技术是多年生黑麦草种质创新的有效方法。

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Drought resistance analysis of regenerated plants from calli of Lolium perenne carried by the Shenzhou No．7 spaceship

PENG Limei1，2，CAO Li1，3，HAN Lei1，QIAN Yongqiang1，SUN Zhenyuan1*
1.Research Institute of Forestry，Chinese Academy of Forestry，Key Laboratory of Forest Cultivation，State Forestry Administration，Beijing 100091，China；2.Palm Landscape Architecture Co.，Ltd.，Shanghai 200433，China；3.College of Agriculture Yanbian University，Yanji 133002，China

Three mutants with high drought tolerance（SP-64，SP-119，SP-17）have been screened from plants regenerated from the embryogenic calli of the Lolium perenne variety Derby，which were carried aboard by the Shenzhou No．7 spaceship．This paper presents the results of an evaluation of the physiological responses to drought treatment for these 3 mutants．As drought duration increased，the relative water content and chlorophyll content of the mutants decreased，whereas malondialdehyde（MDA）and soluble proline content increased．However，the 3 mutants’superoxide dismutase（SOD）activities at first decreased and then increased．The variation ranges of indices were different for each mutation．A comprehensive analysis of these indices suggests that drought tolerance decreased in the order of SP-64，SP-119 and SP-17，which is consistent with the results of the apparent permanent wilting index（APWI）．These results indicate that space mutation could induce the mutagenesis of drought resistance and so provide new germplasm resources for the breeding of turf-grass varieties．

Lolium perenne；space treatment；embryogenic calli；drought resistance

10．11686／cyxb20150109 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

彭丽梅，曹丽，韩蕾，钱永强，孙振元．多年生黑麦草愈伤组织航天搭载后再生株系的抗旱性研究．草业学报，2015，24（1）：64-71．

Peng L M，Cao L，Han L，Qian Y Q，Sun Z Y．Drought resistance analysis of regenerated plants from calli of Loliumperenne carried by the Shenzhou No．7 spaceship．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（1）：64-71．

2013-11-11；改回日期：2014-06-22

国家“863”计划项目（2007AA100105，2009AA102109）资助。

彭丽梅（1987-），女，湖南隆回人，研究实习员，硕士。E-mail：penglimeihuagong＠163．com

*通讯作者Corresponding author．E-mail：sunzy＠caf．ac．cn