不同NO3--N /NH4+-N配比对紫花苜蓿盛花期生长及结瘤固氮的影响

范俊俊，刘晓静，张晓玲，齐 鹏

(1.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学 资源与环境学院,甘肃 兰州 730070)

不同NO3--N /NH4+-N配比对紫花苜蓿盛花期生长及结瘤固氮的影响

范俊俊1，刘晓静1，张晓玲1，齐 鹏2

(1.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学 资源与环境学院,甘肃 兰州 730070)

在完全营养液条件下，采用砂培法，研究了NO3--N与NH4+-N两种氮素形态的7种配比(氮素水平210 mg/L)对紫花苜蓿盛花期生长及结瘤固氮的影响。结果表明：各形态配比下紫花苜蓿的株高、生物量、根瘤数、根瘤重及固氮酶活性均随NO3--N/NH4+-N增大呈先增大后减小的趋势；且NO3--N/NH4+-N比例为5/3时，紫花苜蓿的株高、生物量、根瘤数、根瘤重及固氮酶活性均取得最大值，而地上部和地下部全氮含量则在5/5时最高。综合分析，当氮素水平在210 mg/L时，5/3处理下紫花苜蓿生长较好，自身固氮能力较强。

紫花苜蓿；NO3--N/NH4+-N；生长；结瘤固氮

氮素既可以被作物以阴离子NO3--N形式吸收，也可以被作物以阳离子NH4+-N形式吸收[1]，且这两种形态是植物吸收利用的两种主要氮源形式[2]。铵态氮可直接被植物利用合成氨基酸，而植物吸收的硝态氮则必须经过还原形成铵态氮后才能被利用[3]。从生物能学的角度来看，铵态氮在同化前不需要被还原，应该是植物优先利用的氮源[4]。因此，对于大多作物而言，植株在NO3--N营养下生长良好。研究表明，NO3--N可以促进植物根系的长度生长以及表面积和密度的增加[5]，NH4+-N可以促进紫花苜蓿生物量积累和结瘤固氮[6]。裴文梅等[7]用营养液培养甘草的研究表明，硝态氮与铵态氮等量配合施用时，甘草根的产量、整株合成的药用成分均最高。与单一的NO3--N或NH4+-N比，NO3--N和NH4+-N以适度比例混合施用可以更好的促进绝大多数旱作作物生长。

有关氮素形态配比对植物的影响报道很多，而在最适氮素浓度下NO3--N/NH4+-N对紫花苜蓿影响尚未见报道。为了进一步研究氮素形态不同配比对‘甘农3号’紫花苜蓿盛花期生长及结瘤固氮的影响，采用砂培法，在一定氮素水平下(210 mg/L)，研究不同的配比对‘甘农3号’紫花苜蓿盛花期生长及结瘤固氮的影响，以期为紫花苜蓿合理的氮素供应提供理论依据和数据支撑。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试品种‘甘农3号’紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.3)，供试菌株为中华根瘤菌(12531)，来源苜蓿根瘤和诱变菌株，均由甘肃农业大学草业学院提供。

1.2 试验方法

1.2.1 粗砂处理 将粗砂经自来水冲洗多次，直到冲洗用水不再浑浊为止，再用蒸馏水冲2～3次。121 ℃灭菌，150 ℃烘干后，备用。

1.2.2 种子处理 选取大小均匀，颗粒饱满的紫花苜蓿种子，95%乙醇浸泡5 min，0.1% HgCl2溶液灭菌3 min，无菌水冲洗5～6次，最后用无菌滤纸吸干，备用[8]。

1.2.3 根瘤菌培养 将中华根瘤菌(12531)采用平板划线培养，挑起单个菌落，将其接入YMA液体培养基[9]。在28 ℃下120 r/min的恒温摇床上培养至菌液的光密度值(D600nm)≥1.0时，再在10 000 r/min下离心10 min，除去上清液用无菌水洗下根瘤菌体并配制成吸光值为0.6的菌悬液，备用。

1.2.4 营养液配置 (1)Fahraeus无氮植物营养液：Na2HPO4·12H2O 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.12 g，柠檬酸铁0.005 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，KH2PO40.1 g，Gibson微量元素1 mL，H2O 1 000 mL，pH 6.5～7.0。

(2)Gibson微量元素液：H3BO32.86 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g ，CuSO4·5H2O 0.08 g，MnSO4·4H2O 2.03 g ，Na2MoO4·2H2O 1.26 g，H2O 1 000 mL[10]。

1.3 试验设计

选用直径16 cm、高20 cm 的花盆，装入经自来水冲洗再用蒸馏水清洗并经过高温灭菌的粗砂10 kg。每盆播种100粒灭菌种子，播种14 d后进行间苗，每盆定苗50株，然后浇入营养液，置于塑料防雨棚内。根据前期试验结果[11，12]设氮素水平为210 mg/L(以纯氮计)，设NO3--N、NH4+-N两种氮素形态7种配比，NH4+-N/NO3--N分别为12.5/87.5；25/75；37.5/62.5；50/50；62.5/37.5；75/25；87.5/12.5，即：1/7、1/3、3/5、5/5、5/3、3/1、7/1,共7个处理，每处理重复10次，完全随机排列。以Fahraeus无氮植物营养液为基本营养液，分别加入Ca(NO3)2和(NH4)2SO4配制所需氮素浓度，并调节pH7，结合无氮营养液一同施入。

2014年4月10日播种，每日喷浇3次蒸馏水，每次100 mL，直至对生真叶完全展开；之后每周淋浇1次配制营养液，每次500 mL；每7 d用蒸馏水淋洗盆栽1次以防止砂培中盐分积累，而后浇入新配置营养液。紫花苜蓿生长至三片复叶时，每盆接种新培养的苜蓿根瘤菌液50 mL。在盛花期测定紫花苜蓿株高，生物量，根瘤数，根瘤重，固氮酶活性及全氮含量。

1.4 测定方法

每个处理随机取30株单株测定植株高度，取平均值；取样洗净用滤纸吸干地上部和地下部水分，放入烘箱105 ℃下杀青15 min，再在65～75 ℃下烘干至衡重，称其干重，每个处理重复6次。

每处理取10株，统计单株根瘤数。将每个单株上摘下的根瘤在电子天平上称根取鲜根瘤重，每个处理重复10次。

固氮酶活性采用乙炔还原法测定[13，14]。称取0.2 g的新鲜根瘤置于11 mL玻璃瓶中，加盖橡皮塞后，从中吸出1.1 mL空气，注入1.1 mL乙炔，室温下反应30 min后，待机器稳定后，用微量注射器抽取混合气体50 μL注入气相色谱仪(GC)进样柱中，测定C2H2、C2H4峰值。然后，在同样条件下用标准乙烯测定并绘制乙烯的标准曲线，由此计算根瘤样品的固氮酶活性。每个处理3次重复。测定仪器为GC-7890F气相色谱仪，柱温170 ℃，进样器140 ℃，FID检测器150 ℃。气体压力N2为0.3 mPa，H2为0.08 mPa，空气为0.15 mPa。C2H4水平μmol/(g·h) =h·x(样品峰面积)×C(标准C2H4水平，μmol/mL)/ hs(标准C2H4峰面积)×24.9×t(C2H2反应时间，h)×m(瘤重，g)。

植株全氮含量采用浓H2SO4-H2O2法测定[15]，每个处理重复3 次。

1.5 数据处理

采用Excel 2003软件进行数据整理，并用SPSS 17.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 NO3--N/NH4+-N对紫花苜蓿盛花期株高、地上、地下生物量的影响

在供氮水平一定的条件下，随NO3--N/NH4+-N增大，株高呈先增后减的趋势(表1)，NO3--N/NH4+-N为5/3时，其株高为39.33 cm，显著高于其他处理(P<0.05)。植株高度是衡量牧草生长状况的重要指标，与产量呈正相关，高植株通常有更高的相对产量潜力[16]，因此，5/3处理时地上生物量也最大。当NO3--N/NH4+-N大于5/5时，NO3--N所占比例大的处理地上生物量大于NH4+-N比例大的处理。地下生物量随处理的不同与地上生物量基本呈相同的变化趋势，其最大与最小值分别出现在5/3和3/1处理。

表1 NO3--N /NH4+-N配比下紫花苜蓿的株高、地上、地下生物量Table1 Effects of NO3--N /NH4+-N on the plant height,aboveground and underground biomass of alfalfa

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.2 NO3--N/NH4+-N对紫花苜蓿盛花期根瘤数、根瘤重和固氮酶活性的影响

从量化的根系形态指标能够较为直观的判断硝铵配比对紫花苜蓿长势的影响。除1/7外，随着NO3--N/NH4+-N比例的增加，根瘤数先增加后减小(表2)。根瘤数在5/3处理下达到最大，为每株36.3个；7/1处理时根瘤数最少，每株仅为11.3个。植株单株根瘤数越多，其根瘤重越重。根瘤干重与鲜重均与根瘤数呈现相同的趋势，且5/3处理时最重，与其他处理差异显著(P<0.05)。根瘤数、根瘤重均表现为NH4+-N>NO3--N。固氮酶活性的高低反映其固定大气中氮的能力强弱。NO3--N/NH4+-N为5/3时，固氮酶活性最高，显著高于其他处理(P<0.05)，与最低处理1/3相比增加了67.8%。由此可见NO3--N/NH4+-N为5/3时，紫花苜蓿自身固氮能力最强。

表2 NO3--N /NH4+-N配比下紫花苜蓿的根瘤数、根瘤重和固氮酶活性Table2 Effects of NO3--N /NH4+-N on root nodule number,root nodulation and nitrogenase activity of alfalfa

2.3 NO3--N/NH4+-N对花苜蓿盛花期地上和地下部全氮含量的影响

地上部和地下部全氮含量在NO3--N/NH4+-N为5/5时最高(图1)，分别为2.76%和2.47%，显著高于其他处理(P<0.05)。地上部分全氮含量NO3--N/NH4+-N为5/3时最小，为2.03%；处理1/7、1/3、5/5、3/1、7/1显著高于5/3和3/5，而1/7、1/3、3/1、7/1之间差异不显著。地下部分全氮含量在3/1处理下最低，为1.87%；由此可见，当氮素水平一定时，NO3--N/NH4+-N比例并不是影响紫花苜蓿全氮含量的主要因素。

图1 NO3--N/NH4+-N配比下紫花苜蓿的地上、地下部全氮含量Fig.1 Effects of NO3--N/NH4+-N on aboveground and aboveground nitrogen content of alfalfa

3 讨论与结论

研究报道，施氮不仅能提高紫花苜蓿的生物产量[17]和种子产量，还能增加其干物质和氮素积累量[18]，可明显改善紫花苜蓿的品质[19]。朱祝军等[20]研究发现，适宜的硝态氮与铵态氮配比有利于菜豆的生长发育。董守坤等[21]在大豆的研究上表明NH4+-N 和NO3--N的共同存在更有利于大豆的生长。Britto等[22]认为,在高比例的硝态氮或铵态氮处理下,过多的能量消耗用于 NO3--或NH4+的转移,从而导致蛋白质和糖类合成的减少。孙园园等[23]发现菠菜在铵硝配比为25∶75 的营养液中产量最高，铵硝配比超过50∶50 时产量下降。试验研究表明：盛花期，NO3--N/NH4+-N<5/3时，地上以及地下生物量均大于NO3--N/NH4+-N>5/3的处理。NO3--N/NH4+-N为5/3时，株高显著高于其他处理，而地上生物量与地下生物量分别显著高于除1/7和5/5以外处理。因为NO3--N和NH4+-N同时存在于生长的介质中会相互影响彼此的吸收速率及吸收动力学，NO3--N可以促进植物对NH4+-N的吸收[11]，在硝态氮供应充足的情况下，根系多吸收了铵态氮，从而促进了根系的生长[24]。另外，适当增施铵态氮促进了地上部的生长，光合作用增强，因此，生物量也会增加。Walch-Liu等[25]也发现的铵态氮易导致植物体内激素平衡的失调和细胞分裂素含量急剧下降,降低氮同化能力，从而影响作物的产量。

根瘤固氮酶活性是衡量豆科植物固氮有效性的重要指标。蒯佳林[26]研究发现，NH4+-N 培养下紫花苜蓿根瘤数量、根瘤固氮酶活性和均明显好于NO3--N 培养。宋海星等[27]研究表明，NO3--N与NH4+-N 均不同程度地抑制根瘤固氮酶活性，但NH4+-N对根瘤固氮的抑制作用明显低于NO3--N。叶芳等[11]研究发现，适量的NO3--N和NH4+-N均能促进紫花苜蓿结瘤固氮，但二者以一定的比例混合效果更佳。试验研究表明：氮素水平一定时，NO3--N/NH4+-N为5/3时，根瘤数，根瘤重最大；而NO3--N/NH4+-N>5/3时，根瘤数、根瘤重以及固氮酶活性均减小，这与以上学者的研究结果相一致，并得出了NO3--N/NH4+-N的最佳配比。

在氮素水平为210 mg/L下，NO3--N /NH4+-N比例为5/3，即NO3--N /NH4+-N为62.5/37.5时，紫花苜蓿生长较好，且自身固氮能力较强。

[1] 黄俊,周旭燕,刘莉.不同铵硝配比对弱光下白菜氮素吸收及相关酶的影响[J].中国生态农业学报,2011,19(4):783-787.

[2] 钟丽华,宋世威,刘厚诚.不同铵硝配比对芥蓝产量和品质的影响[J].中国蔬菜,2012(8):63-67.

[3] 武维华.植物生理学[M].北京:科学出版社,2003:105-110．

[4] Britto D T,Kronzucker H J.NH4+toxicity in higher plants：a critical review．Journal of Plant Physiology，2002，159:567-584．

[5] Linkohr B I,Williamson L C,Fitter A H,etal.Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis[J].The Plant Journal,2002,29:751-760.

[6] 俞艳,刘晓静,齐敏兴,等.pH和氮素形态对紫花苜蓿根瘤特性的影响[J].草原与草坪,2012,32(5):7-11.

[7] 裴文梅,张参俊,王景安.不同氮形态及配比对甘草生长及品质的影响[J].中国农学通报,2011,27(28):184-187.

[8] 张琴,张磊,魏世清,等.钙离子对紫花苜蓿及苜蓿根瘤菌耐酸能力的影响[J].应用生态学报,2007,18(6):1231-1236.

[9] 李剑峰,张淑卿,师尚礼,等.解磷根瘤菌液体培养基类型、水平及透气条件的比较[J].草原与草坪,2010,30(1):28-31.

[10] 孙建光,张燕春,徐晶,等.高效固氮芽孢杆菌筛选及其生物学特性[J].中国农业科学,2009,42(6):2043-2051.

[11] 叶芳,刘晓静,张进霞.氮素形态对紫花苜蓿盛花期生长及结瘤固氮的影响[J].草原与草坪,2014,34(2):1-6.

[12] 蒯佳林,刘晓静,李文卿.不同氮素水平对接种根瘤菌紫花苜蓿生长特性的影响[J].草原与草坪,2010,31(3):56-59.

[13] 姚拓,张德罡,胡自治.高寒地区燕麦根际联合固氮菌研究Ⅰ:固氮菌分离及鉴定[J].草业学报,2004,13:106-111.

[14] Tang C,Hinsinger P J,Drevon J,etal.Phosphorus deficiency impairs early nodule functioning and enhances proton release in Roots ofMedicagotruncatulaL.[J].Annals of Botany,2001,88:131-138.

[15] 鲁如坤.土壤农业化学分析方法[M].北京:中国农业科技出版社,2000:147-170.

[16] Davis R L,Baker R J.Predicting yields from associated characters in Medicago sativa L.[J].Crop Sci,1966(2):492-494.

[17] 刘艳楠，刘晓静，张晓磊，等.施肥与刈割对不同紫花苜蓿品种生产性能的影响[J].草原与草坪，2013(3)：69-73

[18] 胡华锋,肖金帅,等.氮磷钾肥配施对黄河滩区紫花苜蓿产量和品质的影响[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2009,35(2):178-188.

[19] 马孝慧,阿不来提,阿不都热依木,等.氮、磷、钾、硫肥对苜蓿产量和品质影响[J].新疆农业大学学报,2005,28(1):18-21.

[20] 朱祝军,寿森炎,Gerendas J,等.氮素形态和光照强度对菜豆生长和抗氧化酶活性的影响[J].浙江大学学报(农业与生命科学版),1998,24(1):51-56.

[21] 董守坤,刘丽君.利用15 N 标记研究铵态氮与硝态氮对大豆的营养作用[J].大豆科学.2012,31(6):912-914.

[22] Britto D T,Siddiqi M Y,Glass A D M,etal.Futile trans-membrane NH4+cycling:a cellular hypothesis to explain ammonium toxicity in plants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2001,98(7):4255-4258.

[23] 孙园园,林咸永,金崇伟,等.氮素形态对菠菜体内抗坏血酸含量及其代谢的影响[J].浙江大学学报(农业与生命科学版)，2009,35(3):292-298.

[24] 钟丽华,宋世威,刘厚诚,等.不同铵硝配比对芥蓝产量和品质的影响[J].中国蔬菜,2012(8):63-67

[25] Walch-Liu P,Neumann G,Bangerth F,etal.Rapid effects of nitrogen form on leaf morphogenesis in tobacco[J].Journal of Experimental Botany,2000,51(343):227-237.

[26] 蒯佳林.氮素形态及供应水平对紫花苜蓿生长特性及结瘤固氮的影响[D].兰州:甘肃农业大学,2011:39-40.

[27] 宋海星,申斯乐.硝态氮和氨态氮对大豆根瘤固氮的影响[J].大豆科学,1997,16(4):283-287.

Effects of the ratios of NO3--N /NH4+-N on growth,nodulation and nitrogen-fixation of alfalfa at flowering stage

FAN Jun-jun1,LIU Xiao-jing1,ZHANG Xiao-ling1,QI Peng2

(1.CollegeofGrasslandScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China；2.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystemofMinistryofEducation/Sino-U.S.CentersforGrazingLandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China;3.CollegeofResourcesandEnvironmentalScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)

Under the condition of complete nutrient solution,the effect of 7 ratios of NO3--N/NH4+-N (the nitrogen level was 210 mg/L) on growth，nodulation and nitrogen-fixation of alfalfa were studied at flowering stage by sand culture method.The results showed that along with the increase of NO3--N/NH4+-N ratio,plant height,biomass,nodule number,nodule weight and nitrogenase activity showed a trend of increasing first and then decreasing under different ratios of NO3--N/NH4+-N.The plant height,biomass,nodule number,nodule weight and nitrogenase activity of alfalfa achieved the maximum at 5/3,while the total nitrogen content of aboveground and underground were highest at 5/5.Under the nitrogen level of 210 mg/L,alfalfa performed best under 5/3 treatment and the nitrogen-fixing ability was the strongest as well.

alfalfa;ratios of NO3--N /NH4+-N;growth;nodulation and nitrogen-fixation

2014-12-08；

2014-12-24

国家自然科学基金(31460622)；甘肃省财政厅项目“外源氮素供应对紫花苜蓿产量和品质形成影响研究”资助

范俊俊(1989-)，男，甘肃天水人，硕士研究生。 E-mail：fan1990124@163.com 刘晓静为通讯作者。

S 144.5

A

1009-5500(2015)01-0044-05