不同放牧强度下冰草自然居群的遗传多样性分析

秀 花

(西藏农牧科学院 草业科学研究所，西藏 拉萨 850009)

不同放牧强度下冰草自然居群的遗传多样性分析

秀 花

(西藏农牧科学院 草业科学研究所，西藏 拉萨 850009)

采用ISSR分子标记技术对不同放牧强度下冰草自然居群的遗传多样性进行了研究。结果表明，放牧导致冰草部分位点丢失，但整个冰草居群仍表现出丰富的多态性，ISSR检测的多态性条带比率为96.46%，居群间的遗传差异很小，放牧并未使冰草居群产生遗传分化。由Shannon’s和Nei’多样性指数检测的各个引物在4个冰草居群内的遗传多样性的大小排列顺序为：中度放牧样地>重度放牧样地>无放牧样地>轻度放牧样地。

冰草居群；ISSR；放牧强度；遗传多样性

冰草属(Agropyron)为禾本科早熟禾亚科大麦族小麦亚族植物。全世界近百种，我国共有15种，主要分布欧亚大陆温带、北美大草原、美国、加拿大。在欧亚大陆中，俄国、蒙古、和中国北部最为丰富，是典型草原、荒漠草原和草原地区沙地及西北半农半牧区的常见牧草。

冰草属于优等牧草，具有抗旱、耐寒、耐碱、耐践踏、寿命长、分蘖能力强等特性，营养丰富，抽穗期营养价值最高，消化率高，草质柔软、适口性良好，在冬春饲草缺乏起着重要的作用。是放牧和打草兼用型牧草，并已广泛驯化栽培作为草地补播草种。

有关冰草遗传多样性的研究报道很多，阎贵兴[1]发现冰草属植物不同种间存在核型多型性；云锦凤等[2]对蒙古冰草B染色体进行了分析；解新民[3]对蒙古冰草遗传多样性研究结果表明，蒙古冰草种内居群间及同一居群内的不同个体间存在丰富的多样性；李景欣等[4]利用根尖压片法，从细胞水平对来自6个不同居群的冰草的遗传多样性进行研究发现，冰草种内居群间存在一定程度的分化和变异，一些北美国家有关冰草的研究，主要侧重其生态建设、耐牧性及营养物质的运输和储存等。近年来，ISSR分析技术在品种鉴定和种质资源的遗传多样性研究中得到广泛应用，有关冰草不同放牧强度下遗传多样性的研究报道较少，试验应用ISSR分析技术对不同放牧强度下的冰草遗传多样性及其分化进行研究，并为探索合理的放牧制度和草地利用方式，防止草原放牧和放牧草原的恢复提供理论基础，为筛选耐牧基因提供遗传学信息。

1 材料和方法

在植物生长旺盛期按株采集冰草(Agroptroncristatum)新鲜叶片。株距50 m以上，选择株丛径中等、生长正常的植株30株，剪去叶片，用保鲜膜包好放入冰盒带回实验室，贮存于-20 ℃冰箱备用。

1.1 试验地自然概况

试验地位于内蒙古自治区赤峰市克什克腾旗达里诺尔国家级自然保护区境内砧子山以东，N 116°381′～116°411′，E 43°251′～43°271′，气候属于中温型大陆性气候，年平均气温为1～2 ℃，≥10 ℃积温1 300～1 700 ℃，年降水量350～400 mm,无霜期为60～80 d,植物生长期4～9月,土壤类型为暗栗钙土。

草原群落随放牧强度的变化，在居民点或家畜饮水点周围相继分布的环状带上最明显，即由此向外辐射，沿半径方向构成草原群落的放牧梯度，因此，在试验区以居民点为一端，沿草原群落变化的方向设置样带。按照放牧草原分级方法，将草地划分为轻度放牧样地、中度放牧样地、重度放牧样地和无放牧样地(夏季无放牧的围封区)。

1.2 DNA的提取与检测

称取0.25 g新鲜叶片。采用CTAB法提取每个植株的总DNA，用0.7%的琼脂糖电泳检测DNA质量， DNA的纯度和浓度通过紫外吸收法测定。

1.3 ISSR反应条件及程序

PCR反应体系的建立主要通过对DNA浓度、引物等条件进行初步的调整，达到了反应条件的优化，确定了ISSR扩增反应总体积为25 μL,反应体系：其中，包括10×buffer 2.5 μL,2.0 mmol/L MgCl22 μL,0.1 mmol/L dNTPs 0.4 μL,0.15 mmol/L ISSR引物1 μL,40 ng基因组DNA,1单位TapDNA聚合酶。以上各种加完后用灭菌三蒸水补齐至25 μL。

扩增在PE9600型PCR仪上进行。扩增程序为94 ℃预变性5 min,94 ℃变性45 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,进行44个循环,最后72 ℃补平5 min,4 ℃停止。扩增产物用2.8%琼脂糖凝胶(内含溴化乙锭)电泳鉴定，电泳1.5～2.0 h，将凝胶放在自动凝胶成像系统下进行分析。

1.4 引物筛选

以无放牧样地的冰草DNA为材料，对30个ISSR引物进行筛选，筛选出12个扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物用于ISSR-PCR反应。引物由上海生物工程公司合成(表1)。

表1 ISSR所用引物序列与序号Table1 Primer sequence and serial number adopted ISSR

1.5 扩增产物和差异带的分析方法

1.5.1 带的记录 电泳图的每一条带(DNA片段)，均为一个分子标记(Marker)，代表一个引物的结合位点。根据各分子标记的迁移率及其有无统计所有的二元数据；有带(显性)记作1，无带(隐性)记作0，强带和弱带的赋值均为1。

1.5.2 数据的统计分析法 应用POPGEN32软件对冰草种间遗传结构进行分析，计算Nei基因多样性指数(H)，Shannon表型信息指数(I)，群体分化系数(Gst)等；根据Nei遗传距离用类平均聚类方法(UPGMA)进行系统聚类，分析群体间遗传分化关系。

2 结果与分析

2.1 多态位点比率

表2列出了在4个冰草居群中检测到的多态位点数及百分率。在无放牧居群中共检测到105个位点，其中，多态位点82个，占71.93%；在轻度放牧居群中共检测到93个位点，其中，多态位点69个，占60.53%；中度放牧居群中检测到106个位点，其中多态位点90个，占78.95%；重度放牧居群中检测到98个位点，其中多态位点77个，占67.54%。在冰草种内检测到114个位点，多态位点110个，占96.49%。多态位点在居群内从大到小的分布是中度放牧>无放牧>重度放牧>轻度放牧居群。每一个引物扩增出的DNA带的数目在2～12，扩增出的DNA带的大小在300～1 500 bp之间。

表2 4个冰草放牧系列居群的多态位点比较Table2 Polymorphic loci comparison between 4 grazing series populations of Agroptron cristatum

2.2 遗传多样性分析

利用Shannon’s指数，根据每个引物在不同居群扩增的ISSR表型结果的差异和出现的频率不同，计算冰草居群遗传多样性并列于表3，由表3可以看出，同一引物在不同居群中估计的遗传多样性指数不同；不同引物在同一居群内所估算的数值也不相同。其中，引物36541在中度放牧居群中故测的数值最高为0.608 3，引物31672在轻度放牧居群中故测的最低为0.062 1，Shannon’s指数故测的4个冰草居群内的遗传多样性由大到小的顺序为中度放牧居群(0.455 5)>重度放牧居群(0.388 9)>无放牧居群(0.382 6)>轻度放牧居群(0.322 6)。

根据表4，引物31669估算的居群内遗传多样性(Hpop)最高(0.459 2)，引物31675估算的居群内遗传多样性最小，只有0.248 2，12个引物估算的居群内遗传多样性平均是0.387 4；对种内总的遗传多样性(Hsp)的估算，引物22893估算数值最高0.587 9，引物31 675估算数值最低0.333 8，平均值为0.517 5。

由Shannon’s指数估计的居群内遗传多样性在引物31 676中最大为87.73%，引物31674最小为63.23%，居群内遗传多样性平均值为74.86%，居群间遗传多样性从12.27%(引物31676)到36.77%(引物31674)，居群间遗传分化的平均值为25.14%。说明放牧干扰对冰草居群的分化程度有所影响，但是，由于不同放牧居群所处的地理自然环境相同，居群之间并未产生隔离，仍存在基因交流，因而没有哪个居群拥有特有的位点或等位基因。但是，并非所有等位基因在不同居群均有分布，有的位点在不同的居群上有丢失现象。

表3 Shannon’s指数估算的4个冰草居群内的遗传多样性Table3 Genetic diversity of 4 Agroptron cristatum populations estimated by Shannon`s index

表4 Shannon’s 多样性指数估算的居群内、居群间遗传多样性及分化Table4 Genetic diversity and differentiation in population and among populations estimated by Shannon`s index

由Nei’s指数估算的各个引物在4个冰草居群内的遗传多样性(表5)检测中，引物36541在中度放牧居群中估测的数值最高为0.419 6，引物31672在轻度放牧居群中估测的数值最低为0.042 1，遗传多样性在中度放牧居群最高(0.311 3)，轻度放牧居群最低(0.217 0)，按遗传多样性的大小排列各居群顺序为：中度放牧居群(0.311 3)>重度放牧居群(0.263 7)>无放牧居群(0.255 8)>轻度放牧居群(0.217 0),这与Shannon’s多样性指数检测的遗传多样性指数一致。

表5 Nei’s指数估计的4个冰草居群内的遗传多样性Table5 Genetic diversity of 4 Agroptron cristatum populations estimated by Nei’s index

2.3 遗传结构与基因流

植物的基因型在居群内和居群间不随机分布，在不同居群之间，同一居群的不同亚居群之间，甚至在同一个体的不同后代之间都存在显著的遗传差异。根据表6，Nei’s指数计算的冰草种内总遗传多样性的平均值为0.348 9，居群内遗传多样性平均值为0.261 9，居群间的遗传分化为21.95%，说明有21.95%的遗传变异存在于居群之间，78.05%的遗传变异存在于居群内。不同引物所占的比例不同，其中，引物36543最高为34.47%，引物31667最低为11.80%，各个引物的Nm值差异较大，从11.283 4到1.501 8不等，平均值为4.080 8。

表6 Nei’s指数估算的居群内、居群间遗传多样性及分化Table6 Genetic diversity and differentiation in population and among populations estimated by Nei’s index

2.4 遗传距离与遗传相似度分析

根据12个引物ISSR扩增产物的电泳结果，按Nei方法计算出4个不同放牧强度冰草居群的遗传距离和遗传相似度。轻度放牧居群和重度放牧居群遗传距离最远，为0.221 9，遗传相似度最小0.801 0，这表明两者之间的遗传差异最大；中度放牧居群和无放牧居群遗传距离最近0.118 6；遗传相似度最高0.888 2，说明这辆个居群的遗传差异最小(表7)。

表7 4个放牧系列冰草的遗传相似度及遗传距离Table7 Genetic similarity and genetic distance between 4 grazing series populations of Agroptron cristatum

注:星号为对角线

图1是根据遗传距离所构建的UPGMA聚类图，图中无放牧居群和中度放牧居群首先聚为一类，其次，轻度放牧居群和无放牧居群、中度放牧居群聚为一类，最后，重度放牧居群和其他3个居群聚为一类，这说明无放牧居群和中度放牧居群遗传差异最小，中度放牧居群和其他3个居群的遗传差异大一些(图2)。

图1 不同放牧强度冰草居群ISSR分析的UPGMA聚类图Fig.1 UPGMA dendrogram of Agroptron cristatum population ISSR analysis under different grazing intensities

3 讨论

植物居群遗传变异水平和遗传结构与其适应性和进化潜力密切相关。个体的遗传变异、居群的遗传分化保证了植物对异质环境的适应，利于居群的生存繁衍。

张红梅[8]在研究未放牧利用的居群和长期放牧后又围封的居群中发现，放牧压力使大针茅居群的少数位点缺失、突变，同时有新的位点出现，但居群间的遗传差异很小，放牧未使大针茅产生遗传分化。试验通过ISSR分子标记分析结果也表明不同放牧压力下，冰草居群的Nei’s指数和Shannon’s指数的估算都显示出大量的分子变异存在于冰草居群内部，少量存在于居群间，说明不同放牧压力下的4个居群具有很相似的基因频率，由于不同放牧居群之间并未产生生境隔离，居群之间仍存在基因交流，因而居群间未产生明显的分化。但是，并非所有等位基因在不同居群均有分布，有的位点在不同的居群上有丢失现象。ISSR的结果分析中，由Shannon’s多样性指数估计的各个引物在4个冰草居群内的遗传多样性的大小排列顺序为：中度放牧样地>重度放牧样地>无放牧样地>轻度放牧样地,这与Nei’s指数检测的遗传多样性顺序一致，这也许说明适度放牧利用对冰草遗传多样性有促进作用。

图2 冰草居群ISSR扩增图Fig. 2 ISSR amplified map of Agroptron cristatum

注：A.引物W31673在无放牧居群扩增谱带；B.引物W31673在轻度放牧居群扩增谱带；C.引物W31673在中度放牧居群扩增谱带；D.引物W31673在重度放牧居群扩增谱带

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Study on ISSR ofAgroptroncristatumat different grazing gradients

Xiuhua

(InstituteofPrataculturalScience,TibetAcademyofAgricultureandAnimalHusandryScience,Lhasa850009,China)

The genetic diversity ofAgropyroncristatumunder different grazing intensity was studied with ISSR molecular marker technology. The results showed that although some polymorphic loci were missed due to grazing, the whole wheatgrass population still exhibited the rich polymorphism. Polymorphicbands ratio detected with ISSR was 96.46%, the genetic differences among populations was small, grazing did not produce genetic differentiation. Genetic diversity of each prime in 4 wheatgrass populations estimated by Shannon’s and Nei’s diversity index was: moderate grazing>severe grazing>banning grazing>light grazing.

Agropyroncristatum; ISSR;grazing;genetic diversity

2014-11-29；

2015-01-05

西藏牧区“生产、生态、生活”保障技术集成与示范项目(2012BAD13B04)资助

秀花(1977-)，女，内蒙古人，助理研究员，硕士，从事草地生态和管理工作。 E-mail：xiuhua621@163.com

Q 786

A

1009-5500(2015)01-0009-07