固相萃取－超高效液相色谱法测定兵器工业生产废水中14 种硝基酚类物质残留浓度

刘玉，张同来，杨利，刘芮，刘影

(1.北京理工大学 机电学院，北京100081;2.潍坊市食品药品检验检测中心，山东 潍坊262500)

0 引言

随着兵器工业的发展，多硝基多酚类点火药因其优异的特点，已经被广泛应用于点火药的设计和生产中［1-3］。本文主要研究的三硝基苯酚(苦味酸PA)、三硝基间苯二酚(斯蒂酚酸TNR)和三硝基均苯三酚(TNPG)等硝基酚化合物(见图1)，是一类具有全身毒性的化合物。硝基酚在被用作炸药的同时，也被广泛用于农药、医药、染料以及橡胶工业生产中，这些物质能在自然环境中长期存在、积累和扩散，通过食物链对动植物的生存及人类的健康造成不良影响。目前，对废水中硝基酚类有毒难降解有机物的控制是水污染防治中的重要课题之一［4-5］。

检测环境介质中的硝基酚成为环境分析中的一个新研究热点。目前，多硝基酚类物质的研究多集中在污染治理方面［6-9］，检测方法局限于总量的检测，多硝基酚污染物的分离、定性、定量检测研究还存在着很大的缺陷［10］。同时其他硝基酚类的检测方法主要有分光光度法［11］、微分脉冲伏安法［12-14］、气相色谱法［15］、液相色谱法［16-17］、气相色谱-质谱联用法［18］等，这些相关的方法都只涉及部分硝基酚类，对于适合多硝基酚类特殊的强极性、热不稳定等化学性质的定性、定量检测方法研究较少。

本研究采用固相萃取(SPE)前处理方法，较其他前处理方法，如加速溶剂提取(ASE)［19-21］，微波辅 助 提 取(MAE)［22-24］和 超 声 波 辅 助 提 取(USE)［25-27］等，具有选择性强、溶剂使用量少、可对被测物富集等优点。通过对SPE 柱、液相色谱条件的选择和优化，建立了SPE-超高效液相色谱法同时测定生产环境水样中14 种硝基酚的简单、快速且适合大批量样品的定性、定量分析方法，并成功应用于生产环境水中实际样品的分析，对调查我国生产环境水中硝基酚的污染现状和环境控制具有重要意义，同时也为多硝基多酚类含能材料及其分解产物的分离和检测提供了技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

AcquityTM 超高效液相色谱仪(UPLC)，配美国Waters 公司二极管阵列检测器;美国Beckman 公司AllegraTM X-22R 型离心机;上海科导公司Sk8200LH 超声波清洗器;Milli-QA10 超纯水机;美国Agilent 公司32 位SPE 装置;IKAMS3 漩涡混合器;美国Waters 公司0.45 μm 过滤膜。

14 种硝基酚类标准品见表1 所示。

SPE 柱(6 mL，0.5 g):Polymer SampliQ DVB、Bond Elut Plexa、Bond Elut C18、Bond Elut ENV(Agilent 公司产)，甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck 公司产)，甲酸、乙酸铵(分析纯)，实验用水为超纯水。

实验用空白环境废水和化学合成区废水均来自于某兵工厂生产废水。

1.2 标准品制备

用乙腈将标准品配制成浓度为100 ～1 000 mg/L的单标标准储备液，再将单标标准储备液稀释配制成不同基质、不同浓度的混标使用液。

1.3 样品净化

SPE 柱活化:依次用2.0 mL 甲醇、2.0 mL 水活化小柱。

上样:控制流速1.5 mL/min，上样5.0 mL 水样。

淋洗:2.0 mL 水淋洗，并抽干1.5 min.

洗脱:3.0 mL 洗脱剂洗脱，洗脱液在温度为45 ℃、水浴条件下，氮吹浓缩至0.5 mL，经0.45 μm滤膜过滤后待测。

1.4 超高效液相色谱分析条件

分析色谱柱:Accucore PFP 2.1 ×150 mm i.d.，2.6 μm;进样体积:5 μL;流速:0.3 mL/min. 流动相为A:10 mM NH4AC +0.1%甲酸，B:乙腈。采用梯度洗脱:0 ～16 min，B 25% ～50%;16 ～22 min，B 50% ～60%;22 ～23 min，B 60% ～25%;23 ～25 min，B 25%.

其中，在流动相选择上，考虑到14 种硝基酚标准溶液紫外最大吸收均在200 ～220 nm 左右，选择测定波长为220 nm，这与甲醇的最大吸收波长非常接近。但是，如果用甲醇作流动相，会引起基线的漂移和波动，故流动相选择在200 nm 附近处低吸收的乙腈体系。

为选择合适的色谱柱，对色谱柱填料和被测物的结构、相互吸附性质进行研究，选择全氟苯基色谱柱，在优化的流动相组成及pH 值和梯度洗脱等色谱条件下，如图2 所示，14 种目标物标准品可获得完全的基线分离。

图2 14 种硝基酚标准品的液相色谱图Fig.2 Liquid phase chromatogram of 14 nitrophenol products

2 固相萃取条件的优化

2.1 固相萃取柱的选择

SPE 柱因其填料的不同可选择的种类很多，具体实验工作中，需根据分析对象、检测手段及实验室条件合理选择合适填料、合理规格的SPE 柱。SPE柱的选择要综合考虑SPE 柱对分析对象的萃取能力、对杂质的吸附净化效果、样品溶液的体积及样品溶液中被测物及干扰物的总量等。实验选取4 种有针对性的SPE 小柱，具体种类见表2.

表2 4 种SPE 柱的特性Tab.2 Characteristics of 4 SPEs

实验选取不含待测化合物的环境废水样品添加14 种硝基酚类标准品，浓度为5 mg/L，采用1.3 节的操作步骤，考虑到液相流动相的乙腈体系，暂以乙腈为洗脱剂，测得各目标物的回收率如图3 所示，综合考虑14 种硝基酚通过各SPE 小柱的回收率。结果显示，14 种硝基酚通过Bond Elut Plexa 固相萃取小柱净化后的回收率均在可接受范围。

图3 不同SPE 柱对回收率的影响Fig.3 Effects of different SPEs on recovery

2.2 固相萃取上样量的选择

实验使用的Bond Elut Plexa SPE 小柱的填料量为0.5 g. 使用不含待测化合物的环境废水样品分别配制10.0 mg/L、20.0 mg/L、30.0 mg/L、40.0 mg/L 和50.0 mg/L 的添加标准品水样，上样5.0 mL，考察SPE 小柱的吸附容量，结果如图4 所示。可见，质量浓度在10.0 ～30.0 mg/L 水平的样品回收率在70%以上，而40.0 mg/L 加标水样回收率开始降低，可见已经超出所用SPE 小柱填料的吸附负荷，因此对于浓度较高的样品，分析前需要对样品进行稀释。

图4 上样量对固相萃取回收率的影响Fig.4 Effect of sample amount on SPE recovery

2.3 洗脱溶剂及其用量的选择

选择适合Bond Elut Plex SPE 柱使用的甲醇、乙腈、四氢呋喃作为洗脱剂，上样为加标样浓度为5. 0 mg/L 的空白环境水样，考察不同洗脱剂的洗脱、回收率，实现样品的最大回收。结果如图5 所示，选择洗脱剂回收率较高四氢呋喃作为洗脱剂。

图5 洗脱剂对固相萃取回收率的影响Fig.5 Effect of eluent on SPE recovery

分别选择1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL 四氢呋喃对淋洗过的小柱进行洗脱，分别接洗脱液进行检测，计算回收率，结果见图6. 由图6 可知，3 mL 四氢呋喃洗脱时，平均回收率较高，满足回收率的要求，再增加洗脱剂体积，不但不会明显改变洗脱效率，而且会导致萃取后样品的稀释，给后续浓缩、富集过程带来不必要的麻烦。因此，本研究选用3 mL四氢呋喃作为SPE 的洗脱溶剂。洗脱液水浴45 ℃、氮吹浓缩至近干，乙腈定容1 mL，经0.45 μm 滤膜过滤后待测。

图6 洗脱剂用量对固相萃取回收率的影响Fig.6 Effect of dosage of eluent on SPE recovery

2.4 样品pH 值对固相萃取回收率的影响

环境废水样品，往往具有一定的酸碱度，所以有必要考察水样pH 值对方法的影响。选择加标浓度5.0 mg/L 的空白环境水样，用甲酸和NaOH 溶液分别调节pH 值为2、3、5、7、9，以考察回收率。从图7可见，pH 值在2 ～9 范围内，随着样品的pH 值的降低，经SPE 处理回收率逐渐增高。综合考虑SPE 柱的酸碱耐受性，选择上样前调节环境废水样品为pH值为2.

图7 样品pH 值对固相萃取回收率的影响Fig.7 Effect of pH on SPE recovery

综合以上SPE 的最优条件，取空白环境废水样品添加5.0 mg/L 标准品，选择Bond Elut Plexa SPE柱，四氢呋喃为洗脱剂，萃取、净化、富集后进液相色谱检测，色谱图如图8 所示，SPE 对环境废水复杂基质样品的萃取、净化效果较好，基质效应对定量结果的影响较小，可以忽略，可以避免使用基质标准曲线，定量方法更快捷。

图8 环境废水中14 种硝基酚的液相色谱图Fig.8 Chromatogram of 14 nitrophenol products in environmental waste water

3 结果与讨论

3.1 方法的线性关系与检出限

在优化的实验条件下，以配制0.1 ～20.0 mg/L系列混合标准工作液。以各组分峰面积y 对浓度x(mg/L)绘制标准曲线，如表3 所示。结果表明，14 种硝基酚类在各自的线性范围内具有良好的线性关系，相关系数为0. 997 3 ～0. 998 7，可以满足定量分析的要求。按3 倍信噪比计算环境废水样品中14 种硝基酚的检出限LOD 为0.02 ～0.04 mg/L.

3.2 方法的准确度与精密度

分别在0.2、1.0、10.0 mg/L 水平下进行环境废水样品基质加标回收实验，每个水平重复测定5 次，14 种硝基酚的平均回收率为82.5% ～104.8%，相对标准偏差3.2% ～5.7%，均符合痕量残留检测的要求，结果见表4 所示。

3.3 实际样品测定

为了验证方法的实用性，选择采集某合成区域环境废水样品，采用本方法进行检测分析，并添加0.3 mg/L 的14 种标准品进行加标回收验证，结果见表5. 从表5 中可见化学合成区环境废水样品检出有4-硝基苯酚、2，4-二硝基苯酚和一定浓度的2，4，6-三硝基间苯二酚污染，同时各硝基酚加标回收均在80% ～110%之间，方法满足实际应用要求。

表3 在环境废水样品基质中14 种硝基酚类线性方程、相关系数、检出限Tab.3 Linear equations，correlation coefficients and LOD for 14 nitrophenol products in environmental waste water

表4 14 种硝基酚类在环境废水样品基质中添加回收率、精密度Tab.4 Recoveries and RSDs of 14 nitrophenol products in environmental waste water

4 结论

1)本文从SPE 柱选择、上样体积和样品pH、洗脱剂选择及用量等方面，确定了SPE 前处理方法在生产环境废水中14 种硝基酚类物质的测定最优条件。利用本方法处理后的样品，色谱图杂质干扰少，基线平稳，可达到忽略基质效应影响的效果。

2)建立了生产环境废水样中14 种硝基酚类化合物的SPE-超高效液相色谱分析方法。14 种不同极性硝基酚类化合物在同一色谱条件下实现基线分离。平均加标回收率为82.5% ～104.8%;相对标准偏差在3.2% ～5.7%之间。由实际样品的检测结果可知，本方法具有简便快捷、灵敏、准确等特点，可作为常规的检测方法应用于生产环境水样中痕量硝基酚类污染物的分析测试。

表5 某合成区域环境废水样品加标回收试验Tab.5 Detecting results of 14 nitrophenol residues in production areas of Environmental waste water

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