用ELISA方法检测猪瘟病毒抗体水平的操作步骤及注意事项

2015-02-22吴立君

畜牧兽医科技信息 2015年12期

关键词：洗涤液板框孵育

吴立君

（黑龙江职业学院第二校区，黑龙江哈尔滨 150111）

用ELISA方法检测猪瘟病毒抗体水平的操作步骤及注意事项

吴立君

（黑龙江职业学院第二校区，黑龙江哈尔滨 150111）

当前规模化猪场对猪病的诊断越来越依赖于实验室诊断数据，对基层畜牧兽医实验室技术而言，运用ELISA（酶联免疫吸附试验）进行检测疾病的技术推广势在必行。本文以检测猪瘟抗体水平为例，详细讲解实验操作流程及北方冬季操作的注意事项，旨在对猪场基层实验人员有指导意义。

当前规模化养猪场越来越重视用实验室诊断数据来指导防疫工作，对此实验室人员及基层防疫人员的实验技术直接关系到猪场的防疫工作的部署，现阶段来看，ELISA技术在基层尚属难操作实验，本文就以检测猪瘟病毒抗体水平为例，详细讲解实验步骤及北方操作实验的注意事项，希望对从事检疫工作的基层实验人员有所帮助。

1 实验目的

检测猪瘟血清或血浆中特异性抗体，为猪场防疫工作提供依据。

2 试剂、器材及设备

2.1 试剂爱德士（IDEXX）公司生产猪瘟病毒抗体检测试剂盒（Classical Swine Fever Virus Antibody Test Kit）；去离子水。

2.2 器材单道和8道微量移液器（30～300μL），枪头，量筒，烧杯，避光盖板，计时器，加样槽，EP管架，PE手套、一次性乳胶手套、口罩、帽子、鞋套、防护服，吸水纸。

2.3 设备自动洗板机，酶标仪，电脑，温箱，空调等。

3 操作步骤

3.1 接收新的猪瘟病毒抗体检测试剂盒时，检查内容物组分，保质期，用标记笔在盒子显著地方标记开启时间、每个组分试剂的中文名称以及每次使用酶标板的数量。

3.2 操作前将试剂盒组分恢复室温18～26℃2h。

3.3 待检血清混匀，试剂盒内组分试剂轻轻涡旋、旋转混匀。

3.4 填写实验室操作规范记录表。例如：操作人：某某某，操作时间：2015-11-11，试剂盒种类：猪瘟病毒抗体检测试剂盒。批号：D191，效期：2016-5-31。

3.5 EP管架上留出四孔，余下待检的血清按照顺序竖排摆放。剩余的酶标板卸下，封闭放置与干燥剂一起放入原袋子中。按照血清顺序，将猪血样标号竖排填写到记录中。

3.6 用一次性PE手套盖住加样槽，将适量的样品稀释液倒入加样槽中。每个孔中用加入50μL样品稀释液。注意枪头勿触到酶标板底部，加样槽中余下的试剂切勿倒入瓶中。

3.7 开启新枪头盒，每孔加入血清50μL，缓慢吹打3～5次混匀，避免产生气泡，每加入一孔更换一次枪头，使之一一对应。竖排加样，顺序为先加入阴性血清，2孔，阳性血清，2孔，待检血清，若干孔。

3.8 用封口膜封闭酶标板，避免液体蒸发，盖上避光板，在室温18～26℃孵育2h。（也可采用过夜孵育模式，4℃孵育12～18h）。

3.9 孵育期间，配制1倍洗涤液。计算出本次检测所需洗涤液用量。例如所需总体积200mL，取10倍浓缩液20mL加入180mL超纯水，混匀，备用。

3.10 孵育完毕后，打开避光板，揭开封口膜，握住酶标板框，避免触到酶标板底部，垂直将液体倒入废液桶中。采用时手动洗板，将配置好的洗涤液倒入加样槽中，用多道移液器吸入300？l洗涤液加入每个反应孔中，轻轻晃动混匀后，手握酶标板框，垂直弃掉洗液，反复3次。最后一次弃掉洗液后，用吸水纸上大力扣板，将剩余液体弃掉。在加入酶标抗体之前，避免孔干燥。

3.11 每孔中加入100μL辣根过氧化物酶标记的抗猪瘟病毒的酶标抗体，轻轻晃动混匀，用封口膜盖上，扣上黑色避光板，室温孵育30min。

3.12 重复步骤10。孵育完毕后，打开避光板，揭开封口膜，握住酶标板框，避免触及酶标板底部，垂直将液体倒入废液桶中。将配置好的洗涤液倒入加样槽中，用多道移液器吸入300？l洗涤液加入每个反应孔中，轻轻晃动混匀后，手握酶标板框，垂直弃掉洗液，反复3次。最后一次弃掉洗液后，用吸水纸上大力扣板，将剩余液体弃掉。

3.13 将底物倒入加样槽，每孔加入100μL底物，盖上黑色避光板，将酶标板避光放置10min。

3.14 提前开启酶标仪预热，设置参数。

3.15 按照加入底物的顺序，每孔加入终止液100μL，终止反应。

3.16 尽快将反应板放入酶标仪中，读取数值并命名保存。

3.17 血样及试剂盒及时放回保存地点。