干细胞向雌性生殖细胞分化的研究进展

王 茜，李玉艳 综述，梁志清审校

(第三军医大学西南医院妇产科，重庆 400038)

·综 述·

干细胞向雌性生殖细胞分化的研究进展

王 茜，李玉艳 综述，梁志清△审校

(第三军医大学西南医院妇产科，重庆 400038)

干细胞；胚胎干细胞；成体干细胞；诱导性多能干细胞；雌性生殖细胞

近年来，医学对于女性肿瘤患者的关注已从生存时间和生存率，逐步转为如何保留患者的生育能力。其中部分患者即使通过辅助生殖技术也无法获得有功能的卵子，利用干细胞技术获得卵细胞不仅可以为这类患者解决无法生育的难题，而且可能在研究器官发生发育、濒危动物保护、基因治疗等方面起到重要作用[1-5]。根据干细胞所处的发育阶段和分化性质不同，将干细胞分为3类，包括：胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESCs)，成体干细胞(adult stem cell,ASCs)，以及诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSCs)。现将近期各种干细胞向雌性生殖细胞分化的研究进展综述如下。

1 ESCs向雌性生殖细胞的分化

ESCs具有发育全能性，能分化为机体的任意一种细胞类型，包括：生殖细胞[1-2]。Hubner等[6]于2003年首次报道成功诱导鼠ESCs在体外分化为卵母细胞，表达生殖系的特异RNA和蛋白标记物。Hu等[7]进行pFigla-EGFP重组质粒的构建，并进行诱导分化，最终将一部分GFP+细胞分化为类卵母细胞。Hayashi等[8]则报道利用mESCs先分化培养出外胚层样细胞，在更换培养基添加骨形成蛋白(BMP)4、BMP8a等培养3～4 d，将外胚层样细胞分化为原始生殖细胞(PGCLCs)，并将该类原始生殖细胞与12.5 d的雌性胚胎性腺细胞共培养，再将共培养细胞团移植至小鼠卵巢包膜下，最终发现该类原始生殖细胞分化发育为胚泡期卵母细胞。该卵母细胞周围依附着类似颗粒细胞的FOxI2+细胞。于体外促成熟后，该胚泡期卵母细胞可进一步进入减数分裂Ⅱ期，再利用体外授精技术，最终成功产生健康、有生育功能的后代。近期，Wan等[9]研究发现维A酸和齐墩果酸均有诱导小鼠ESCs R1/E (MESC-R1/E)向生殖细胞分化的潜能。利用MESC-R1/E来源形成的胚胎小体(EBs)在正常的细胞培养板生长，然后分别加入维A酸、齐墩果酸，72 h后，均增加了MESC-R1/E向生殖细胞的分化，并且数据分析显示，维A酸可以诱导MESC-R1/E分化为雌性生殖细胞，而齐墩果酸则可以诱导MESC-R1/E分化为雄性和雌性两种生殖细胞。Geens等[10]将人ESCs与鼠支持细胞共培养，可以有效提高人ESCs分化为生殖细胞样细胞，对比他们前期实验发现同样有效促进人ESCs分化的BMP4，认为一种或多种诱导因子与人ESCs共培养，可以有效提高hESCs的分化。

综上，虽然ESCs是雌性生殖细胞的理想来源，并且多个实验证明，ESCs可以诱导为类卵母细胞[6-10]，甚至小鼠ESCs细胞经体外分化培养后已成功诞生后代小鼠[8]，但是，ESCs诱导为卵细胞的具体机制仍然清楚，且有潜在的畸胎瘤形成风险、免疫排斥风险及伦理争议等诸多无法逃避的问题，也注定ESCs在人类和动物的研究受到限制[11]。

2 ASCs向雌性生殖细胞的分化

ASCs是一种具有修复和再生能力的干细胞，存在于成人的各种组织和器官当中，实验表明，在一定条件下，ASC会进行自我更新而形成新的干细胞，或者进行分化而形成功能细胞[3]。

2.1 骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell BMSCs) BMSCs是目前应用较广泛的一类ASCs[12]。Santiquet等[13]尝试将BMSCs移植到经过化疗药物处理的PU.1小鼠和重症综合性免疫缺陷(SCID)小鼠及胎牛卵巢，但结果显示移植BMSCs仅提高了SCID小鼠的生育率。Ghasemzadeh等[14]则比较了小鼠雄性和雌性来源的BMSCs在向生殖细胞诱导时特异标记物的表达水平，发现Dazl和Rnf17均不表达，绝大多数检验基因在二者表达水平几乎相等。而雄性来源的BMSCs高表达Piwil2，很可能与其在雄性生殖细胞的分化过程扮演重要角色有关。进一步结果分析发现，雌性来源的BMSCs更易分化为雌性生殖细胞。虽然BMSCs已被证实有潜在分化为卵母细胞的潜能[12-14]，但免疫排斥和临床捐助者有限等问题限制了其临床应用[12]。

2.2 脐带基质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell UCMSCs) UCMSCs同样是一种具有多项分化潜能的ASCs，且来源更加方便[12]。自2003年开始，许多实验室都开始进行UCMSCs的分离和其多能性的检验。Ghasemzadleh等[14]报道利用卵泡液或卵巢提取液体外诱导UCMSCs形成了EBs及类似卵母细胞的大细胞结构，并且表达原始生殖细胞标记物；进一步通过精卵泡液(PFF)小鼠模型，发现人UCMSCs能够在卵巢局部存活并生长。2013年，Qiu等[15]探讨了人UCMSCs来源于不同性别是否会影响生殖细胞的形成，分别选取培养男性胎儿来源的UCMSCs和女性胎儿来源的UCMSCs，同样利用20%的卵泡液进行诱导。研究结果发现，二者都可以分化为类卵母细胞并且表达生殖细胞标记物，但是女性胎儿来源的UCMSCs生殖细胞特异标记物的表达更早，雌二醇更高，形成的类卵母细胞也更大。

2.3 其他ASCs Dyce等[16]在前期发现胎儿猪皮肤来源的干细胞可以分化为类卵母细胞的基础上，进一步研究发现新生小鼠皮肤来源的干细胞有向卵母细胞分化的潜能。Xiao等[17]则在近期报道分离了CD117+/CD44+的人羊膜液干细胞，发现该细胞不仅表达生殖细胞特异标记物，并且在5%的POF的培养基中，有接近2%的成体卵细胞(hAFSCs)分化成减数分裂期的生殖细胞并表达卵泡生成和卵子形成相关标记物。

ESCs卵母细胞分化不同，目前无ASCs分化所得卵母细胞的排卵、受精能力的报道。但临床来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，避免了免疫排斥反应及伦理道德问题等优势，使其成为卵子的理想来源[18]。若能进一步优化体外培养诱导方法、探明非卵巢来源干细胞体外分化及替代治疗机制，将为体外获得卵子进而为体外受精治疗提供新的希望。

3 iPSCs向雌性生殖细胞的分化

iPSCs是利用技术将转录因子导入体细胞内，使体细胞发生重编程从而成为多能干细胞[4]。这些细胞有两个重要属性,自我更新能力和分化成人体的任何细胞类型的能力。可能有助于理解疾病的机制、制作新疾病模型、药物开发/药物毒性的测试,基因疗法,细胞替代疗法等。所以该细胞在临床应用和基础研究中都具有极大利用价值[19]。

Takahashi等[20]于2006年，首次报道了体细胞来源的iPSCs，在2007年，他们又通过逆转录病毒将关键多能基因：Oct3/4,Sox2,Klf4,和c-Myc(Yamanaka 因子) 导入成人上皮纤维母细胞而首次产生出人iPSCs[21]。Medrano等[22]则发现，利用过表达Vasa或Dazl的iPSCs可以分化为原始生殖细胞，并且可以通过减数分裂过程达到成熟，并认为在进化上具有无关性的和相异的RNA结合蛋白可以促进人类来源的生殖细胞在体外的减数分裂。2013年，Niu等[23]建立了iPSCs系，在经过3 d的悬浮培养后可以自主分化为EBs，表达3个胚层的特异标记物。然后，通过加入维A酸和POF培养得到的EBs并最终分化为类卵母细胞，因此认为由iPSCs分化可以分化为类卵母细胞。而近期，Medrano等[24]进一步发现，利用成人来源的iPSCs，在添加猪皮凝胶的培养基中进行卵母细胞的诱导分化，14 d后，显微镜下形态学提示，分化细胞类似卵母细胞，并且包括Vasa、SCP3在内的多种生殖细胞标记物呈高表达。同ASCs一样，虽然大量实验结果提示iPSCs具有向雌性生殖细胞分化的潜能[20-24]，但还未报道分化所得卵母细胞具有排卵、受精能力。此外，潜在遗传和表观遗传异常发展导致的肿瘤性，不同基因诱导的iPSCs的分化和发育潜能存在差异等问题[20]，提示寻求一个更有利于向生殖系发育的iPSCs显得尤为重要。

5 展 望

找到理想的卵子来源，是解决女性肿瘤患者不孕的关键。干细胞诱导分化为雌性生殖细胞的研究，为由于各种原因导致无法产生有功能卵子的女性患者带来了曙光。虽然，目前有实验已经证实可以由干细胞诱导分化为有功能的卵母细胞并产生后代，但还无法保证所有诱导出的类卵母细胞都具有功能，并且诱导分化过程的具体机制等也还不清楚，均需要进一步的研究证实。

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:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.16.044

国家自然科学基金资助项目(31101058)；重庆市自然科学基金资助项目(CSTC2011jjA10075)。

王茜(1990-)，硕士在读，主要从事生殖医学研究工作。

△通讯作者，Tel:13320332902;E-mail：zhi.lzliang@gmail.com。

Q21

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1671-8348(2015)16-2274-03

2014-11-08

2015-02-10)