自噬与慢性肝炎病毒感染

刘 青综述，傅 念审校

（南华大学附属南华医院消化内科，湖南衡阳421002）

自噬与慢性肝炎病毒感染

刘 青综述，傅 念审校

（南华大学附属南华医院消化内科，湖南衡阳421002）

自噬； 肝炎，乙型，慢性； 肝炎病毒； 感染； 综述

自噬即“自我消化”，是将细胞内大分子物质及亚细胞器通过溶酶体途径进行降解以便循环利用，实现物质及细胞器更新的分解代谢过程。慢性肝炎病毒感染是导致肝硬化及肝癌最主要的病因，且目前暂无有效药物能完全清除病毒。近年研究表明，自噬在慢性肝炎病毒感染中扮演着重要角色，本文就自噬与乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒感染的发生机制进行综述，以期为抗病毒治疗提供新途径。

1 细胞自噬

1.1 自噬的概述及分类 自噬是指在细胞受外界环境干扰等情况下利用溶酶体途径，对胞浆内无功能大分子物质和受损的细胞器进行降解、回收、利用，来维持细胞器的更新及细胞本身的代谢需要的生物学过程。在营养充足、外界环境良好等状态下，细胞自噬处于较低水平，然而在氧化应激、饥饿、生长因子缺乏、内质网应激、病毒感染等条件下可短时间内诱导自噬发生，通过清除毒物为细胞提供营养物质及能量[1-2]。

根据生理功能及降解物进入溶酶体方式的不同，一般可将自噬大致分为以下3类：分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediatedautophagy）、微自噬（microautophagy）、大自噬（macroautophagy），其中，大自噬主要分为6个步骤完成：启动、成核、伸长、关闭、成熟、降解或释放。此外，还有非典型性自噬和最新报道的RNA自噬[3]。目前研究最深入的为大自噬。本综述主要论述的是大自噬。

1.2 细胞自噬的分子生物学机制 自噬发生的各个阶段受多种基因的调控，参与自噬编码的基因称自噬相关基因（autophagy-related genes，ATG）。ATG基因编码的蛋白如第三类磷脂酰肌醇3激酶（PI3KC3）以协同的方式参与自噬体形成的各个阶段。PI3KC3是启动自噬的关键酶，其能催化3-磷酸磷脂酰肌醇（PI3P）的形成，对诱导自噬的发生起着重要作用[4]。PI3KC3由3个核心部分组成：hVPS34、p150和Beclin-1[4-5]；Beclin-1可与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）形成复合体（VPS34），参与初级自噬囊泡的形成[6]。自噬的伸展是由Atg12和Atg8/微管相关蛋白1轻链3（micro tubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）2个泛素蛋白共轭系统共同调节，Atg12与靶蛋白Atg5、Atg6共价结合形成Atg12-Atg5-Atg16复合物，募集LC3-Ⅱ结合到隔离膜，并定位到自噬泡中，从而促进自噬泡膜的延长。当自噬体双膜结构形成后，Atg12-Atg5-Atg16复合物脱落，自噬体发育成熟[7]。LC3是酵母菌Atg8在哺乳动物中的同源蛋白，分为Ⅰ型和Ⅱ型，当自噬发生时LC3-Ⅰ转化为定位于前自噬体及自噬体的LC3-Ⅱ型，常用于自噬分子的检测指标。目前已证实，能调节自噬的信号通路主要包括mTOR，Akt/PKB，ERK/MAPK，Ⅰ型和Ⅲ型PI3K等途径。mTOR是目前研究最多的信号通路，其mTORC1（由mTOR，PRAS40，MLST8，Raptor和DEP-TOR组成的复合蛋白体）是其表达形式之一，在营养充足时mTORC1使Atg1人的同源蛋白ULK1和ULK2磷酸化，从而抑制自噬，在营养缺乏时mTOR失活，ULK1和ULK2蛋白解离，去磷酸化被激活，启动自噬发生。

2 慢性肝炎病毒

2.1 乙型肝炎病毒 HBV感染呈全球盛行，目前有近30%的人群通过血清学证据发现感染HBV，慢性乙型肝炎病毒感染患者达3.5亿[8]，其有一部分死于病毒感染所致的肝硬化及肝细胞癌。HBV是一种有包膜的双链DNA病毒，属嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae），HBV的基因组是部分双链环状DNA分子，基因组大小为3.2 kb。其长链有4个开放阅读框（open readingframe，ORF），即Pre-S/S、Pre-C/C、Pol和X，乙型肝炎表面抗原、包膜蛋白（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）及乙型肝炎核心抗原（HBcAg）、HBV多聚酶（Pol）和X多肽（HBx）[9]。其中HBx可在低营养状态下激活细胞自噬水平来提高细胞的存活率[10]。

2.2 丙型肝炎病毒 根据世界卫生组织（WHO）的估计，全世界大概有1.7亿人通过血清学检测发现有丙肝病毒感染，约占总人群的3%，且每年新发丙型肝炎病例达3.5万例[11]。HCV持续感染若未有效控制可进展为肝硬化和肝细胞癌[12]。HCV归类于黄病毒科（Flaviviridae），是黄病毒科的唯一嗜肝病毒，其基因组为9.6 kb长的单股正链RNA分子，基因组两侧由5′末端和3′末端的非编码区（untranslated region，UTR）构成，两UTR之间则是ORF，能编码结构蛋白和非结构蛋白（NS2，NS3，NS4，NS5）；其中结构蛋白包括核心蛋白（C）和包膜蛋白（E1，E2/NS1）。研究表明，在病毒RNA复制中非结构蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B充当重要角色，此外，HCV的非结构蛋白可以诱导自噬并作为自身抗损伤的保护性机制[13]。

目前，核苷（酸）类药物或干扰素已成为慢性乙型肝炎的标准化治疗方案，但上述抗病毒药物存在疗程长，不良反应多，完全应答率不高甚至无应答等不足。临床上慢性HCV感染一般采用干扰素和利巴韦林联合治疗，但一旦发展至肝硬化，干扰素和利巴韦林的疗效则明显下降，或不能耐受。目前急需研发新的抗病毒药物，随着对自噬与肝炎病毒感染的研究，发现抑制自噬可减少病毒复制，这意味着自噬将有可能为抗病毒治疗开辟新路径。

3 细胞自噬与慢性肝炎病毒感染

3.1 细胞自噬与HBV

3.1.1 HBV诱导自噬发生 体内、体外实验均发现，HBV感染肝细胞后会增高细胞自噬水平，而自噬水平的增高又反过来促进了HBV的复制[14-15]。使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA），或者以Atg5和Beclin-1为靶点的shRNA则能抑制自噬体的形成，并抑制HBV的复制，而饥饿诱导或雷帕霉素（西罗莫司）则促进细胞自噬，同时增加HBV的复制[16]。以上研究均表明HBV与自噬相辅相成，相互促进；虽然HBV诱导细胞自噬的具体机制尚不清楚，但近年的研究提示，X多肽（HBx）、HBeAg、HBsAg可能参与了HBV诱导自噬机制的发生。

3.1.2 HBx与自噬 HBx可能通过多种机制参与了细胞自噬的发生：（1）HBx促进自噬体的形成。Liu等[17]发现，Huh7细胞外源表达HBV全基因组蛋白（HBV-DNA）后能显著增加细胞内的自噬体数量，而Huh7细胞外源表达无HBx的HBV基因组蛋白后自噬体数量并没有相应增加，提示HBV依赖于HBx促进肝细胞中自噬体的形成。王娟等[18]也证实，HBV通过HBx增加细胞内基本自噬水平，而且还发现C型HBx比B型HBx更能增加细胞内的自噬水平，提示C型HBx能诱发更强的细胞自噬。（2）HBx通过上调Beclin-1的表达促进细胞自噬。HBx蛋白可通过激活死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK），上调Beclin-1的表达来增强自噬，并且Beclin-1的表达水平与自噬体数目呈正相关[16，19]；（3）HBx抑制自噬体的降解。HBx除可以提高自噬的表达外，还可以通过抑制溶酶体的成熟及正常酸化从而阻止自噬体的降解[17]。

3.1.3 HBeAg与自噬 研究发现HBV前C区和C区的启动子G1613A、A1762T/G1764A、G1896A突变能够降低HBV感染肝细胞的自噬水平，同时G1613A、A1762T/ G1764A突变可使HBeAg水平降低[20-21]，提示HBeAg可能与自噬有相关性，但仍需进一步研究。然而，前C区与X区存在大部分重叠，细胞自噬水平的降低是因为HBeAg水平的变化还是HBx水平的变化所致还有待进一步研究。

3.1.4 HBs与自噬 由于自噬主要作用于HBV病毒包装，因此有人认为，HBs基因才是引起自噬的主导因素，通过突变分析研究，HBV小表面蛋白（HBV small surface protein，SHBs）可引发自噬，并且可以激活未折叠蛋白应答（unfolded protein responses，UPR），而阻断UPR信号通路则可消除SHBs所诱导的LC3-Ⅰ的脂化，使细胞自噬水平下降[16]。

3.2 细胞自噬与HCV的关系

3.2.1 HCV诱导自噬发生 HCV感染肝细胞后也能诱导细胞自噬的发生。Ati Goughoulte等[22]用1a基因型HCV感染正常肝细胞后电镜下可观察到自噬体积聚，而且荧光显微镜下观察到自噬相关基因Atg5和自噬标记物LC3的水平较对照组明显增加。Sir等[23]也发现，HCV感染后自噬相关基因如Beclin-1、Atg5、Atg7和Atg12的表达会上调，但聚泛素结合蛋白（p62）及长寿蛋白等的降解未发生明显的改变。因此，作者猜测HCV诱导的自噬为不完全自噬。另外，HCV可利用自噬增加HCV在细胞内的复制[24]。如果通过抑制Beclin-1、ATG12、ATG4B的表达抑制自噬体的形成，HCV的复制水平则有可能会降低，从而有利于提高抗病毒疗效。有趣的是，HCV诱导细胞自噬的发生与HCV病毒基因分型和外周血HCV RNA水平无相关性[25]，作者发现，不同基因型和HCV RNA水平的HCV感染使用干扰素和利巴韦林治疗的疗程和疗效是不一样的，降低HCV感染细胞的自噬水平则有可能对不同基因型和HCV RNA水平的HCV感染均能发挥抗病毒作用。HCV诱导细胞自噬的机制还不是很清楚，可能与UPR和非结构蛋白的作用有关。

3.2.2 HCV通过激活UPR诱导自噬 Huang等[26]发现，HCV通过激活内质网应激反应诱导细胞自噬的发生，以抑制PKB-TSC-Mtorc1信号通路。在细胞中转染HCV JFH1 RNA可以诱导UPR和不完全自噬，沉默3个UPR信号分子中的任何一个，可使LC3-Ⅱ的生成减少和HCV复制水平下降。HCV感染时，c/EBP同源蛋白（c/EBP homologousprotein，CHOP）在UPR自噬信号中起关键作用[27]。但也有人认为HCV诱导细胞自噬与内质网应激无关[28]，Mohl等[29]研究发现，HCV感染诱导的自噬，伴随着LC3-Ⅱ的聚集，这种变化发生在病毒感染前期，而UPR的刺激只发生在病毒感染的后期，这是否意味着HCV可不通过UPR诱导自噬或是HCV不依赖于UPR诱导自噬，因此还有待进一步研究。

3.2.3 HCV通过非结构蛋白激活自噬 除了病毒触发的内质网应激和UPR，非结构蛋白可能是HCV激活自噬的另一信号。Su等[13]发现，HCV的非结构蛋白NS4B可以通过Rab5和Vps34的相互作用触发不完全细胞自噬。此外，HCV非结构蛋白NS5A也能激活细胞自噬反应[30]，NS5A可能通过激活NS5ATP9上调Beclin-1的表达，从而诱导细胞自噬的发生[31]。Gregoire等[32]发现，HCV NS3通过IRGM与Atg5和LC3的相互作用来调节细胞自噬。

3.3 两种慢性肝炎病毒诱导自噬的相同点与不同点

对比自噬在HBV和HCV中作用的异同可以发现，2种病毒感染不仅可以增强细胞自噬，还可以利用自噬来促进自身在宿主体内复制。然而，HBV诱导的自噬是完整的，而HCV诱导不完整的细胞自噬，HBV可通过HBx、HbeAg、HBs等诱导自噬，而HCV通过UPR、非结构蛋白等诱导自噬，HBV诱导的自噬与基因型有关，而HCV诱导的自噬不依赖HCV的基因型。

4 小结与展望

肝炎病毒感染-病毒携带状态-慢性肝炎-肝硬化-肝癌这一发展路径已被公认，其关键是抗病毒治疗。目前HBV感染仍用IFN-α或核苷（酸）类似物治疗，HCV感染已有HCV NS3蛋白酶抑制剂（PD）、NS5A与NS5B多聚酶抑制剂等新型药物，但仍存在耐药性及不良反应，且病毒完全应答率不高等缺点，因此抗病毒药物仍有待进一步研究。自噬作为细胞代谢的重要途径，对细胞内环境的稳定及物质的更新至关重要，当自噬受抑制时，大量异常的蛋白质及受损的细胞器在细胞内聚集，从而干扰细胞代谢及物质更新，诱导疾病的发生。近年来大量的研究表明，HBV和HCV均能诱导细胞自噬，并且利用自噬可增强自身的复制，而相反，抑制细胞自噬则会使HBV及HCV的复制减少，这使细胞自噬作为抗病毒治疗成为可能，然而现在对自噬在病毒感染所发挥作用的认识尚浅，病毒感染如何调节自噬通路，如何利用自噬控制复制，需要更深入的研究才能更好地为病毒感染的治疗提供帮助。

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A

1009-5519（2015）20-3085-04

2015-05-11）

刘青（1987-），女，湖南长沙人，硕士研究生，主要从事肝硬化防治研究；E-mail：598053742@qq.com。

傅念（E-mail：15874787447@163.com）。