口蹄疫病毒样颗粒研究进展

魏 婕，魏玉荣，易 忠（新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆 乌鲁木齐 830000）

口蹄疫病毒样颗粒研究进展

魏 婕*，魏玉荣，易 忠（新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆 乌鲁木齐 830000）

病毒样颗粒（VLP）具有与真实病毒粒子大小相似的结构，能引起免疫应答但不具有感染性。口蹄疫病毒是无囊膜的RNA病毒，其结构蛋白可组装成VLP，且具有良好的免疫原性。本文对口蹄疫病毒VLP的免疫机制、表达系统及应用、口蹄疫病毒VLP作为抗原在诊断和疫苗中的应用进行了综述。

蹄疫病毒；病毒样颗粒；疫苗

许多病毒的结构蛋白在不同的培养系统中具有组装成重复序列或者病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）的能力。这种VLPs大小一般为22~150 nm，由于他们不携带遗传物质，因此不具有感染性。VLPs能够重复并且高密度的展示抗原位点，能引起强烈的免疫反应，因此为该病毒疫苗研究提供了极具潜力的方法。某些病毒的VLPs与病毒的亚病毒粒子（subviral particles，SVPs）相似，这些VLP能直接作为疫苗使用。除此之外，VLP还能作为载体，插入外源的抗原位点形成嵌合型的VLP。VLPs是目前FMDV研究的热点之一，本文将从以下几方面对VLP在口蹄疫病毒中的应用进行综述。

1 VLP的免疫机制

VLPs比亚单位蛋白或者重组蛋白具有更好的免疫原性，它能引起体液免疫以及免疫系统的细胞集合。VLPs为构象抗原的展示提供了空间结构骨架，使得构象更接近于天然的病毒结构，刺激产生更多的中和抗体。

一般来说，蛋白抗原会被MHC II类分子加工并递呈给CD4+T细胞。而VLP被APCs加工后不仅递呈给CD4+T细胞，也会递呈给MHC I分子介导途径的CD8+T细胞。在某些情况下，VLP不需要佐剂就能够刺激潜在免疫。这种VLPs的自我辅助的特点是固有的，存在于刺激先天免疫所必要的过程中，如在递呈给树突状细胞加工、被MHC II类分子展示以及直接引起树突状细胞成熟和迁移的过程中，VLP会被APCs识别并递呈，从而体现其免疫原性[1]。外源的VLP也能被MHC I类分子处理和加工，刺激活化CD8+T细胞，而CD8+T细胞是清除像病毒这类细胞内病原所必需的。VLsP疫苗的重要优势在于能将树突状细胞作为主要靶细胞，而这一类型的细胞作为靶细胞在刺激活化先天免疫和获得性免疫应答中都是必需的。某些VLPs与感染性病毒相似并保留了它们的受体结合区域，这样就能通过它们的正常受体识别途径进入细胞，并作为外源抗原被I类分子递呈[2]。

FMDV是一个单股正链RNA病毒，它的开放阅读框编码结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4。VP1的141-160位的表位肽在单独存在时，不能刺激机体产生保护性中和抗体，但将此表位与其它能提供多个Th细胞位点的大分子载体相连，可刺激机体产生保护性的中和抗体和特异性的T细胞增殖[3]。

2 口蹄疫病毒VLPs的表达系统

口蹄疫病毒的VLPs的研究开始于上世纪90年代，随后研究者们利用多种表达系统对FMDV的VLPs进行研究。表达VLPs有多种表达系统，包括：（1）多种哺乳动物细胞系；（2）昆虫杆状病毒表达系统；（3）各种酵母表达系统；（4）大肠杆菌以及其他细菌表达系统；（5）在体外利用化学方法自我组装成衣壳组件的VLPs[4]。

兔出血症病毒（RHDV）的VLPs是由衣壳蛋白VP60组装而成的二十面体样粒子，RHDV的VLP具有很高的免疫原性并能刺激兔产生保护性抗体[5]。将模型细胞毒性T细胞的表位插入VP60的N末端，组装形成嵌合型的VLP，这种嵌合型的VLP能在小鼠体内刺激产生强烈的特异性地细胞毒性反应并对小鼠产生保护力[6]。E. Crisci等首先将兔出血症病毒的VLP做为展示FMDV 3A表位的载体，并通过不同免疫途径并加入佐剂免疫猪。结果表明，加入佐剂的嵌合型VLPs通过肌肉注射，两周后在猪体内会引起特异性地免疫应答，分别能检测到抗3A表位和RHDV-VLPs的细胞因子。这也是首次关于利用RHDVVLPs作为FMDV抗原位点展示载体的免疫学研究[7]。

MS2是一种雄性特异性大肠杆菌噬菌体，当DNA寡核苷酸插入到MS2衣壳蛋白的单一位点时，便可进行组装并能将蛋白展示于表面的VLPs。Dong等将O/OZK株FMDV的141-160位VP1表位肽插入到MS2的衣壳蛋白中，在大肠杆菌中表达形成VLPs并将VP1表位肽展示在VLPs的表面[8]。纯化后的VLP在电镜下观察约26 nm，经过Western鉴定，表达的VLPs具有很高的FMDV的免疫原性。将纯化的VLPs与弗氏佐剂乳化后注入小鼠、豚鼠和猪，测定显示，利用VLPs展示的表位肽能刺激小鼠、豚鼠和猪产生FMDV特异性保护抗体。该研究还发现，该嵌合型VLP在猪体内能引发强烈的免疫反应并提供部分保护。与传统的灭活疫苗相比，虽然表位肽疫苗具有安全，易操作的优点，但不具有理想的保护力[9]。

传染性法氏囊病毒（IBDV）是一个非囊膜病毒，其二十面体衣壳是由衣壳蛋白VP2形成三聚体后组装而成的，其衣壳蛋白具有自我组装的功能[10]。Michelle利用IBDV VP2能自我组装成一个十二面体的亚病毒粒子的特性，将FMDV VP1 loop环的12个氨基酸插入亚病毒粒子中，用于制备FMDV竞争ELISA的诊断抗原[11]。

Cao等人将Asia I型和O型FMDV的P1-2A-3C序列分别重组到昆虫杆状病毒，利用High Five细胞表达P1-2A-3C蛋白。研究发现，通过密码子优化和启动子的选择能够使P1-2A-3C蛋白大量表达并自我组装形成与真实病毒粒子大小相同的VLP[12]，用此VLPs刺激豚鼠表现出一定的免疫原性和抗原性。但由于VLPs的纯度和含量不够，动物不能产生高水平的中和抗体[13]。

大肠杆菌表达系统表达的外源蛋白质虽然具有易操作、低成本和高表达等诸多优点，但所表达的蛋白质未经修饰且大多以包涵体形式存在，利用该系统表达VLPs不能形成正确的空间构象。因此，为了能使VLPs不仅大量表达并形成正确的空间构象，而且具有良好的免疫原性，研究者们进行了许多有关大肠杆菌可溶性表达的研究。其中，在小泛素蛋白相关修饰（SUMO）融合蛋白系统的研究中取得了较大进展。Lee等将FMDV的VP1、VP0和VP3分别加上His标签和SUMO基团，将三个蛋白同时在大肠杆菌中表达。由于SUMO能增加病毒蛋白的水溶性并防止蛋白在组装成衣壳前聚集成团，因此，FMDV的这三个改造后的结构蛋白在共同表达时形成稳定的异源三聚体复合物。去除SUMO基团后，这三个结构蛋白能形成与FMDV大小一致的VLPs，表达量能达到约5mg/L[14]。

Zhang等将不同的FMDV抗原位点插入HBc的不同位点，对比这些嵌合型蛋白是否能形成稳定的VLPs以及插入的抗原位点是否会抑制其原有的免疫原性。结果显示，只有将FMDV的VP1(141–160)–VP4(21–40)–VP1(141–160)片段插入HBc的75–82 aa位点时，在大肠杆菌表达系统中表达才可形成可溶性的蛋白，并组装成具有完整形态的VLPs[15]。

有研究者将FMDVVP1的抗原优势表位插入到植物病毒中，利用植物表达系统表达能展示此抗原表位的VLPs。Huang等将FMDV VP21的抗原表位插入HBc中，构建植物表达载体，利用致瘤农杆菌LBA4404株转染至烟草植物，在烟叶中检测到含有HBc和VP21的VLPs。粗提烟叶中的可溶性的VLPs蛋白，免疫小鼠后能产生特异性抗体并具有针对FMD的保护力[16]。Zhang等用烟草坏死病毒A（TNV-A）展示FMDV VP1的抗原优势表位肽，利用植物表达后能获得结构稳定的VLPs，经纯化的VLP能引起小鼠的体液免疫[17]。

任晓冰、窦小龙等分别利用猪圆环病毒2型（PCV2）的衣壳蛋白以及牛病毒性腹泻病毒（BVDV）能组装成VLPs的特性，使FMDV中和表位展示于VLPs表面，构建了能分泌表达VLPs的芽孢杆菌表达质粒，并利用枯草芽孢杆菌进行表达，获得了具有反应原性的VLPs[18, 19]。

真核表达系统具有翻译后修饰的优点，使VLPs能够正确的组装。但是若将能形成VLPs的重组蛋白在真核表达系统中同时表达，这些重组蛋白能同时进入同一个细胞的概率很低，在组装VLPs时可能会缺少某一种蛋白从而影响VLPs的组装效率，使表达量较低，因此不适用于VLPs的大量制备。原核表达系统虽然缺少翻译后的蛋白修饰系统，但由于该表达系统的具有低成本、高效率等诸多优点，仍是目前研究的热点。为克服原核表达系统中缺乏翻译后蛋白修饰的缺点，该表达系统还需要进一步的修饰和优化来提高VLPs的组装效率来。此外，影响VLPs表达效率的外界因素仍在进一步研究探索中[20]。

3 口蹄疫病毒颗粒样疫苗

疫苗免疫是控制和预防FMD流行有效的技术方法。目前，大多疫苗的制备都是利用灭活的病毒做为疫苗的抗原。传统的口蹄疫疫苗存在以下缺点：（1）保护期短；（2）制备过程中有散毒的危险；（3）在制备疫苗过程中，非结构蛋白去除不彻底，会造成区分自然感染及免疫动物的困难。为了克服传统疫苗的缺点，利用重组DNA技术的FMD VLPs疫苗应运而生。VLPs是由病毒的结构蛋白通过自我组装，形成与病毒形态相似的构象，并且不具有感染性和复制能力。VLPs能展示与天然病毒极其相似的构象表位，因此能有效地刺激产生体液免疫和细胞免疫应答。

FMDV O/IND/R2/75株在亚洲和欧州国家均被用做疫苗候选株，该株毒与南亚、中东、欧亚以及东南亚地区流行的O型口蹄疫的泛亚谱系，Ind2001和Mya-98谱系具有广泛的抗原覆盖率。Bhat, S.A等将多角体蛋白启动子与O型FMDV（O/IND/R2/75株）的P1-2A和突变后的3C基因克隆到杆状病毒中，在昆虫细胞中表达出了聚合蛋白P1-2A-3C。突变后的3C蛋白降低了野生毒株的蛋白酶活性，提高了结构蛋白的表达量，并将P1-2A剪切成了空衣壳的组成部分VP0、VP3和VP1，最终组装成VLPs。将表达的VLPs免疫豚鼠后产生的中和抗体与传统单价疫苗免疫豚鼠后产生的中和抗体相比，VLPs抗体水平组明显高于传统疫苗组，证明VLPs在豚鼠体内能产生了针对FMD的保护抗体。

Li及其团队构建了包含FMDV AsiaI型的P1-2A和3C序列的杆状病毒Bm-P12A3C，在昆虫细胞中表达FMDV的VLPs，并将此VLPs作为亚单位疫苗抗原免疫牛。通过间接免疫荧光和夹心ELISA检测，证明昆虫杆状病毒载体能表达FMDV的VLPs。通过PD50检测，该疫苗抗原剂量达6.34PD50/头，，超过OIE规定的3PD50/头份的标准。由此可见，利用蚕杆状病毒表达系统所表达FMDV的VLPs可以用于FMD疫苗抗原[22]。B. Mohana等同样利用昆虫杆状病毒构建P1-2A-3C质粒，在Sf9细胞中表达，并组装形成VLP，将VLP加入ISA206佐剂后免疫牛，经过攻毒测定，PD50达到5.01，且两次免疫后可检测到中和抗体[23]。

Guo等人利用SUMO表达系统将FMDV AsiaI型Jiangsu/China/2005株的VP1、VP3和VP0与SUMO融合后在大肠杆菌中共表达，去除SUMO基团后，三个结构蛋白组装形成VLPs。用纯化VLPs分别免疫豚鼠、猪和牛。结果显示，用一剂量50μg蛋白免疫即可引起高水平的免疫应答，且在牛的攻毒试验中PD50可达到6.34。因此表明，利用SUMO在大肠杆菌中表达的VLPs能做为FMDV的候选疫苗[24]。

除了利用FMDV结构蛋白自我组装成VLPs的特性，还可以利用其它病毒自我组装成VLPs的特性将FMDV的主要抗原表位展示于VLPs表面，使其具有与病毒粒子相似的免疫原性，刺激机体产生对FMDV的保护力。Jin等将FMDV的全长VP1序列（639bp）插入乙肝核心抗原（HBc），构建具有CMV启动子和hCG-β前导序列的重组质粒，利用真核表达系统使蛋白分泌表达并组装成VLPs。在该研究中，利用VLPs展示的VP1与单纯VP1相比，前者能刺激小鼠产生高水平的T细胞增殖和CTL应答，所产生﹥32的完全保护性中和抗体[25]。

4 口蹄疫病毒VLPs作为诊断抗原

印度的研究者利用昆虫杆状病毒系统表达A型FMDV的P1-2A和突变3C蛋白，使P1-2A能形成完整的VLP并具有完整病毒的抗原性。将纯化后的重组VLPs作为液相阻断ELISA抗原，与传统弱毒做抗原的液相阻断ELISA相比，检测的敏感和特异性基本相同。用VLP作为抗原可降低散毒的风险，扩大应用范围。因此，VLPs可替代弱毒抗原，用于FMD的血清学检测[26]。

5 展望

目前，VLPs疫苗已成功应用于人类乙肝病毒和人乳头瘤状病毒感染的免疫预防；预防丙肝病毒、埃博拉病毒以及SARS冠状病毒感染的VLPs疫苗也正在研究当中[27]。在动物医学领域中，仅研制成功PCV2和PCV的VLPs载体疫苗并已商业化生产。FMDV的VLPs在多种表达系统中组装与表达是目前研究的热点之一，该病毒的VLPs不论是作为诊断抗原，还是用于制备疫苗，对于FMD的防制都具有重要意义。由于口蹄疫病毒不同血清型以及各亚型之间缺乏交叉保护，因此研究和开发具有较广抗原谱的MFD VLPs疫苗具有良好的应用前景。

[1] Gamvrellis A, et al., Vaccines that facilitate antigen entry into dendritic cells[J]. Immunology and Cell Biology, 2004.（82）: 506–516.

[2] Grgacic, E.V. and D.A. Anderson, Virus-like particles: passport to immune recognition [J]. Methods, 2006，40(1): 60-65.

[3] Shao, J.J., et al., Promising multiple-epitope recombinant vaccine against foot-and-mouth disease virus type O in swine[J]. Clin Vaccine Immunol, 2011，18(1): 143-149.

[4] Pattenden, L.K., et al., Towards the preparative and large-scale precision manufacture of virus-like particles[J]. Trends Biotechnol, 2005，23(10): 523-529.

[5] Perez-Filgueira, D.M., et al., Development of a low-cost, insect larvae-derived recombinant subunit vaccine against RHDV[J]. Virology, 2007，364(2): 422-430.

[6] Crisci, E., et al., Chimeric calicivirus -like particles elicit protective anti -viral cytotoxic responses without adjuvant[J]. Virology, 2009，387(2): 303-312.

[7] Crisci, E., et al., Chimeric calicivirus -like particles elicit specific immune responses in pigs [J]. Vaccine, 2012，30(14): 2427-2439.

[8] Peabody, D.S., et al. Immunogenic display of diverse peptides on virus-like particles of RNA phage MS2. J Mol Biol, 2008，380(1): 252-263.

[9] Dong, Y.M., et al. Promising MS2 mediated virus-like particle vaccine against foot-and-mouth disease [J]. Antiviral Res, 2015，（117）: 39-43.

[10] Coulibaly, F., et al. The birnavirus crystal structure reveals structural relationships among icosahedral viruses[J]. Cell, 2005，120(6): 761-772.

[11] Remond, M., et al. Infectious bursal disease subviral particles displaying the foot-and-mouth disease virus major antigenic site. Vaccine, 2009，27(1): 93-98.

[12] Cao, Y., et al. Formation of virus-like particles from O-type foot-and-mouth disease virus in insect cells using codon-optimized synthetic genes[J]. Biotechnol Lett, 2010，32(9): 1223-1229.

[13] Cao, Y., et al. Synthesis of empty capsid-like particles of Asia I foot-and-mouth disease virus in insect cells and their immunogenicity in guinea pigs. Vet Microbiol, 2009，137(1-2): 10-17.

[14] Lee, C.D., et al. Production of FMDV virus -like particles by a SUMO fusion protein approach in Escherichia coli[J]. J Biomed Sci, 2009，（16）: 69.

[15] Zhang, Y.L., et al. Enhanced immunogenicity of modified hepatitis B virus core particle fused with multiepitopes of foot-and-mouth disease virus[J]. Scand J Immunol, 2007，65(4): 320-328.

[16] YAHONG HUANG, et al. Immunogenicity of the epitope of the foot-and-mouth disease virus fused with a hepatitis B core protein as expressed in transgenic tobacco[J]. viral immunology, 2005，(18): 668–677.

[17] Zhang, Y., et al. Development of Tobacco necrosis virus A as a vector for efficient and stable expression of FMDV VP1 peptides[J]. Plant Biotechnol J, 2010，8(4): 506-523.

[18]任晓冰，等.口蹄疫病毒表位嵌合蛋白在枯草芽胞杆菌中的分泌表达[J].中国兽医科学, 2014，44(3): 287-292.

[19]窦小龙，等.口蹄疫病毒VP1蛋白病毒样颗粒表达系统的构建[J].动物医学进展, 2014. 35(3): 11-14.

[20] Dong, H., H.C. Guo, and S.Q. Sun, Virus-like particles in picornavirus vaccine development[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2014，98(10): 4321-4329.

[21] Bhat, S.A., et al., Novel immunogenic baculovirus expressed virus-like particles of foot-and-mouth disease (FMD) virus protect guinea pigs against challenge[J]. Res Vet Sci, 2013，95(3): 1217-1223.

[22] Zhiyong Li, et al., Expression of foot-and-mouth disease virus capsid proteins in silkworm-baculovirus expression system and its utilization as a subunit vaccine[J]. Public Library of Science one, 2008，3(5).

[23] Mohana Subramanian, B., et al., Development of foot-and-mouth disease virus (FMDV) serotype O virus-like-particles (VLPs) vaccine and evaluation of its potency[J]. Antiviral Res, 2012，96(3): 288-295.

[24] Hui-Chen Guo, S.-Q.S.Y.J., Shun-Li Yang, et al. Foot-and-mouth disease virus-like particles produced by a SUMO fusion protein system in Escherichia coli induce potent protective immune responses in guinea pigs, swine and cattle[J]. Veterinary Resarch，2013,（44）: 13.

[25] Jin, H., et al. Protective immune responses against foot-and-mouth disease virus by vaccination with a DNA vaccine expressing virus-like particles[J]. Viral Immunol, 2007，20(3): 429-440.

[26] Basagoudanavar, S.H., et al. Development of a liquid-phase blocking ELISA based on foot-and-mouth d isease virus empty capsid antigen for seromonitoring vaccinated animals [J]. Arch Virol, 2013，158(5): 993-1001.

[27] Plummer, E.M. and M. Manchester, Viral nanoparticles and virus -like particles: platforms for contemporary vaccine design[J]. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol, 2011，3(2): 174-196.

Advance of Virus-like Particles of Foot-and-Mouth Disease

WEI Jie*，WEI Yu-rong，YI Zhong （Institute of Veterinary Science, Xinjiang Academy of Animal Science,Urumqi 830000,China）

Virus -like particles (VLPs)share the similar structure and immunogenicitywith natural virus particles except absent of viral genes, but still are able to induce the antigen-antibody response, thus could beuse as a promising platform for vaccines.The foot -and -mouth disease virus (FMDV) belongs to the Picornaviridae family and consists of non-enveloped particles that contain a positive-sense, single-stranded RNA of approximate 8.5 kb. The P1-2A precursor is processed by viral protease 3C to produce the structural proteins VP0, VP1 and VP3. These proteins could self-assemble to formempty capsid-like particles. This review will focus on the immunologic mechanism,expression system and application of FMDV VLPs as antigen in vaccine and diagnosis.

FMDV；VLPs；vaccine

S852.65

A

1003－6377（2015）04－0006-05

新疆维吾尔自治区自然基金青年基金项目（2012211B55）

魏婕（1983-），女，新疆人，助理研究员，研究方向：动物病毒学。E-mail：xiaojie0717@aliyun.com

2015-04-09，

2015-04-24