葡萄糖对鹅原代肝细胞增殖的影响

叶凤江，韩春春，刘丹丹，万火福，杨文兰，翁梦珂，苟 丹，龚金祥

(四川农业大学 动物遗传育种研究所，四川 成都 611130)

葡萄糖对鹅原代肝细胞增殖的影响

叶凤江，韩春春，刘丹丹，万火福，杨文兰，翁梦珂，苟 丹，龚金祥

(四川农业大学 动物遗传育种研究所，四川 成都 611130)

【目的】 探讨葡萄糖对鹅肝细胞增殖能力的影响。【方法】 以四川白鹅为供试动物，采用半原位二步胶原酶灌注法采集鹅的肝细胞，之后用含不同浓度(0(对照组，CK)，5，20，35 mmol/L)葡萄糖的培养基培养鹅原代肝细胞，培养48 h后用BrdU免疫荧光染色检测BrdU阳性细胞率，BrdU-ELISA法检测肝细胞DNA含量，ELISA法检测Cyclin D1蛋白质量浓度。反转录聚合酶链式反应检测细胞增殖相关基因(CyclinD1、CyclinD2和CyclinD3)的mRNA表达水平。【结果】 与对照组比较，20和35 mmol/L葡萄糖可以显著增加BrdU阳性细胞率，并可以明显提高原代肝细胞的DNA含量；5和20 mmol/L葡萄糖对Cyclin D1蛋白质量浓度影响不显著，而35 mmol/L葡萄糖对Cyclin D1蛋白质量浓度有显著促进作用。CyclinD1、CyclinD2和CyclinD3的mRNA表达水平随着葡萄糖浓度的增加而升高，其中35 mmol/L葡萄糖的促进作用明显大于其他处理。【结论】 葡萄糖能够促进鹅原代肝细胞的增殖。

葡萄糖；鹅原代肝细胞；细胞增殖

葡萄糖可以调控多种动物和细胞模型的细胞增殖，如大鼠、小鼠和啮齿动物的β细胞系、大鼠前体脂肪细胞、原代培养神经干细胞及新生大鼠下颌骨成骨细胞等[1-6]。在小鼠活体试验中，葡萄糖可以诱导β细胞增殖[7-8]，但有试验证明葡萄糖能够引起β细胞增大，但并没有细胞增殖[9]。在农业生产中通过对水禽进行填饲碳水化合物能够生产肥肝，这与水禽肝脏具有较强的沉积脂质能力及生长增殖能力有关。然而，对于水禽肝细胞增殖能力的研究还未见报道。本实验室前期研究发现，通过对鹅填饲碳水化合物生产肥肝时细胞周期调控因子Cyclin D家族3个基因的表达水平升高，表明在肥肝生成过程中细胞增殖被激活。本研究通过检测葡萄糖对鹅原代肝细胞DNA合成、BrdU阳性细胞率、Cyclin D1蛋白质量浓度及Cyclin D家族3个基因mRNA表达量的影响，探讨葡萄糖对鹅肝细胞增殖能力的影响，为探明碳水化合物在水禽肥肝形成过程中的作用机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试动物 试验用四川白鹅由四川农业大学养禽场提供。

1.1.2 主要试剂与仪器 主要试剂包括Ⅳ型胶原酶、胰酶、青霉素、链霉素双抗(Gibco公司)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS,PAA公司)，PBS(Solarbio公司)，Total RNA Kit Ⅰ试剂盒(Omega公司)，SYBR Premix ExTaqTM试剂盒(Takara公司)；主要仪器有二氧化碳培养箱、荧光定量PCR仪、荧光显微镜、酶联免疫检测仪。

1.2 方 法

1.2.1 原代肝细胞的分离与培养 采用半原位二步胶原酶灌注法[10]，分离3只四川白鹅的肝细胞。将肝细胞接种到35 mL培养皿、24或96孔培养板中，静置在40 ℃、体积分数5% CO2和饱和湿度的培养箱中培养。3 h后用PBS清洗3次后更换为体积分数10%血清培养基，培养24 h后换无血清培养基，再继续培养24 h后更换为添加不同浓度(0(CK)，5，20,35 mmol/L)葡萄糖的无血清低糖DMEM培养基，培养48 h后取样。每处理重复3次。

1.2.2 肝细胞的BrdU 免疫荧光染色 在葡萄糖诱导培养后的肝细胞中加入BrdU (终质量浓度为3 μg/mL)，37 ℃培养箱中孵育2～4 h后，用体积分数2%多聚甲醛固定30 min，用2 mol/L HCl处理30 min，0.1 mol/L硼酸钠中和，体积分数5%血清封闭1 h，加BrdU抗体 (稀释倍数1∶100)，室温下放置1 h；之后加入二抗室温孵育1 h。每张细胞爬片滴加DAPI溶液(终质量浓度1 μg/mL)孵育3 min，用PBS冲洗3次后晾干。显微镜下观察细胞免疫荧光染色结果并记数。BrdU阳性细胞率=绿色荧光点数/蓝色荧光点数。结果为3次相互独立试验的平均值。

1.2.3 肝细胞的BrdU-双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测 在96孔板的肝细胞中加入葡萄糖处理24 h后，每孔加入10 μL BrdU标记细胞。弃去上清液后加入固定液(含体积分数4%多聚甲醛 PBS)，于室温下固定30 min使DNA变性，洗涤3次后加入BrdU一抗，洗涤后加入山羊抗小鼠IgG过氧化物酶共轭结合物，洗涤后添加3,3′,5,5′-四甲基联苯胺 (TMB)过氧化物酶作用底物，之后加入终止反应液终止反应，将96孔板放酶标免疫检测仪上用450 nm波长检测各孔吸光度(OD450)。OD450值越高，表示样品中DNA含量越高。

1.2.4 肝细胞中Cyclin D1蛋白质量浓度的测定 采用ELISA法检测Cyclin D1蛋白的质量浓度，具体按照Cyclin D1蛋白酶联免疫分析试剂盒的说明书操作。

1.2.5 肝细胞中Cyclin D家族3个基因mRNA表达水平的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测 采用Trizol试剂 (Invitrogen,USA )提取肝细胞RNA，之后用反转录试剂盒Primer ScriptTMRT system kit (TaKaRa,Japan)将RNA逆转录为cDNA。采用荧光定量PCR法对CyclinD1、CyclinD2和CyclinD3 mRNA表达水平进行定量分析。所用引物见表1。PCR反应体系为25 μL：SYBR Premix ExTaqTM12.5 μL，上、下游引物(10 mmol/L)分别0.5 μL，模板cDNA 2 μL，余下用ddH2O补齐。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 1 min，共40个循环。每个循环后采集荧光生成扩增曲线， 62～92 ℃缓慢升温，产生熔点曲线,检测引物特异性。所有样本设3个重复，并在每次试验时设阴性对照(不加cDNA模板，用ddH2O补充)。用2-ΔΔCt法[11]计算目标基因的mRNA相对表达水平，以内参基因18S和β-actin进行标准化校正。

1.2.6 统计学处理 数据用“平均值±标准差”表示，采用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度葡萄糖对鹅原代肝细胞增殖及其DNA含量的影响

BrdU-ELISA免疫荧光染色结果见图1，图1中绿色为BrdU染色细胞，即为增殖细胞；蓝色为DAPI细胞核染色。从图1可以看出，随着葡萄糖浓度的增加，染成绿色的BrdU阳性细胞增多。在35 mmol/L葡萄糖处理组中，染色呈现绿色的细胞数量最多，并且绿色细胞团变大，表明肝细胞增殖较其他3组明显。

图1 不同浓度葡萄糖处理后鹅原代肝细胞BrdU 免疫荧光染色结果(×200)
A、B、C、D分别表示用0，5，20 和35 mmol/L葡萄糖处理后的肝细胞
Fig.1 BrdU immunofluorescence cell staining after glucose treatment(×200)
A,B,C,and D indicate glucose treatments with concentrations of 0,5,20 and 35 mmol/L,respectivey

从图2可以看出，BrdU阳性细胞率随葡萄糖浓度的升高而增大，与对照组(0 mmol/L葡萄糖)相比，5 mmol/L葡萄糖的促进作用不显著，20和35 mmol/L葡萄糖显著促进了鹅原代肝细胞的增殖(P<0.05)，表明葡萄糖能显著促进细胞的增殖。

从图3可以看出，与对照组相比，5和20 mmol/L葡萄糖对原代肝细胞中的DNA含量没有显著影响，而35 mmol/L葡萄糖可以显著促进原代肝细胞中DNA含量的升高(P<0.05)。

2.2 不同浓度葡萄糖对鹅肝细胞中Cyclin D1蛋白质量浓度的影响

图4显示，与对照组相比，5和20 mmol/L葡萄糖对Cyclin D1蛋白质量浓度影响不显著(P>0.05)；当葡萄糖浓度为35 mmol/L时，Cyclin D1蛋白的质量浓度显著增加(P<0.05)。

2.3 不同浓度葡萄糖对Cyclin D1、Cyclin D2、Cyclin D3基因表达的影响

不同浓度葡萄糖对CyclinD1、CyclinD2、CyclinD3基因表达的影响见图5。

图5显示，CyclinD1、CyclinD2和CyclinD3的mRNA表达水平都随着葡萄糖浓度的升高而呈上升趋势。与对照组相比，其中5 mmol/L葡萄糖对CyclinD1、CyclinD2和CyclinD3基因的 mR-NA表达水平都无显著影响；与5 mmol/L葡萄糖相比，20 mmol/L葡萄糖对CyclinD1 mRNA表达水平影响显著，而对CyclinD2和CyclinD3 mRNA表达水平无显著影响(P<0.05)；35 mmol/L葡萄糖能显著提高Cyclin D家族3个基因的mRNA表达水平(P<0.05)。

3 讨 论

葡萄糖是动物体主要的能源物质，对细胞的生长和增殖有重要影响。研究表明，高浓度葡萄糖能增加G0/G1期细胞的百分比，降低S期细胞的百分比[12]。研究显示，低浓度葡萄糖能促进MG63细胞和大鼠原代培养前体脂肪细胞的增殖能力，而高浓度葡萄糖能降低MG63细胞和大鼠原代培养前体脂肪细胞的增殖能力[4,13]。Gupta等[14]研究结果显示，高浓度葡萄糖对MCF-7细胞影响不显著，但能明显增强MDA-MB-231细胞增殖。有研究表明，高浓度葡萄糖能促进肿瘤细胞及血管系膜细胞的增殖[14-15]。以上研究表明，不同类型细胞对葡萄糖的耐受能力存在差异。本试验结果表明，葡萄糖能显著促进鹅原代肝细胞增殖，低浓度(0和5 mmol/L)葡萄糖对肝细胞增殖影响不显著，高浓度(20和35 mmol/L)葡萄糖能显著促进肝细胞增殖，说明鹅肝细胞对葡萄糖耐受能力较强。

Cyclin D家族(Cyclin D1、D2、D3)是重要的细胞周期调控因子。研究表明，葡萄糖可以通过影响Cyclin D家族相关因子来调控细胞增殖。在胰腺 β-细胞中，葡萄糖以时间依赖式促进CyclinD1基因的表达[16]。在MDA-MB-231细胞中，高浓度葡萄糖可提高Cyclin D1蛋白浓度，但在MCF-7细胞中高浓度葡萄糖对其没有影响[14]。对细胞周期蛋白基因的分析证实，在出生后小鼠和胰岛素抗性小鼠中，Cyclin D2对于β-细胞增殖非常重要[17-20]。在内质网核1缺失的神经胶质细胞中，葡萄糖匮乏可明显降低CyclinD3 mRNAs的表达水平[21]。有研究表明，葡萄糖对β-细胞CyclinD2激活时需要先对钙离子通道进行激活[22]。有研究认为，敲除碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)后降低了小鼠、大鼠和人β细胞CyclinD2的表达水平[23]。Cyclin D家族通过与周期素依赖性蛋白激酶结合来实现其对细胞周期G1/S转化的调控功能，从而实现对细胞增殖的调控[24]。本试验结果表明，葡萄糖能够提高Cyclin D1的质量浓度，并促进CyclinD1、CyclinD2、CyclinD3基因的表达。可知葡萄糖能够通过激活细胞周期调控因子Cyclin D家族来促进鹅原代肝细胞的增殖。

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Effect of glucose on cell proliferation of goose primary hepatocytes

YE Feng-jiang,HAN Chun-chun,LIU Dan-dan,WAN Huo-fu,YANG Wen-lan, WENG Meng-ke,GOU Dan,GONG jin-xiang

(InstituteofAnimalbreeding&Genetic,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

【Objective】 This study aimed to detect the effect of glucose on the proliferation capability of the goose hepatocytes.【Method】 Goose primary hepatocytes were isolated from Sichuan White Goose using semi-in situ two-step collagenase perfusion isolation procedure and treated with different glucose solutions (0 (CK),5,20,and 35 mmol/L).After 48 h,the rate of BrdU positive cells was measured by BrdU immunofluorescence staining method,the DNA was measured by BrdU-ELISA method,and protein contents of genes involved in cell proliferation were measured by ELISA.Relative mRNA levels ofCyclinD1,CyclinD2 andCyclinD3 were also determined by reverse transcription polymerase chain reaction.【Result】 Compared with control group,20 and 35 mmol/L glucose solutions significantly increased the rates of BrdU positive cells and promoted the DNA contents of goose hepatocytes.5 and 20 mmol/L glucose solutions had no evident effect on protein content of Cyclin D1,while 35 mmol/L glucose significantly increased the protein content of Cyclin D1.Relative mRNA levels ofCyclinD1,CyclinD2 andCyclinD3 increased with the rising of glucose concentration, and the promoting effect at 35 mmol/L glucose was bigger than those of other groups. 【Conclusion】 Glucose could promote the cell proliferation of goose primary hepatocytes.

glucose;goose primary hepatocytes;cell proliferation

2013-10-16

国家自然科学基金项目(31101712)；高等学校博士学科点专项科研基金项目(201151103120006)；四川农业大学本科生科研兴趣培养计划项目(2013015)

叶凤江(1991-)，女，广西桂林人，主要从事特种经济动物养殖研究。E-mail:8744107416@qq.com

韩春春(1980-)，女，山东安丘人，副研究员，博士，硕士生导师，主要从事动物遗传育种与繁殖研究。 E-mail：chunchunhai_510@163.com

时间:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.005

S835；Q78

A

1671-9387(2015)02-0038-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.005.html