猪Jiv基因的克隆表达与多克隆抗体制备

刘 伟，郭抗抗，林 鸷，盛 洁，赵 娣，赵紫印，张彦明

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

猪Jiv基因的克隆表达与多克隆抗体制备

刘 伟，郭抗抗，林 鸷，盛 洁，赵 娣，赵紫印，张彦明

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

【目的】 克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112 bp的基因片段，构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化，制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】 利用RT-PCR方法，从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因，将其克隆到pMD19-T载体并测序，以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv，转化E.coliRosetta(DE3)感受态细胞中，利用IPTG诱导表达，获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化，对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性，以每只新西兰白兔400 μg蛋白的初次免疫剂量和500 μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫，共免疫5次，采集血清，采用间接ELISA法检测抗体效价达到一定水平后，收集抗体，利用Western blot检测抗体特异性。【结果】 克隆得到长度为2 112 bp的猪Jiv基因片段；构建的pET32a-Jiv在E.coliRosetta(DE3)感受态细胞中经诱导后高效表达，SDS-PAGE结果显示，纯化得到分子质量约为95 ku的猪Jiv融合蛋白；测得的猪Jiv蛋白多克隆抗体效价达1∶6 400；Western blot检测结果证实，所获得抗体能够有效地应用于猪Jiv蛋白抗原的检测。【结论】 成功地克隆了猪Jiv基因，制备了抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。

猪Jiv蛋白；原核表达；多克隆抗体；猪瘟病毒

Jiv(J-domain protein interacting with viral protein)蛋白最早发现与致细胞病变型(Cytopathogenic，CP)牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)存在相互作用。Mendez等[1]发现， 自然情况下BVDV NADL株基因组中插入了一段编码90个氨基酸的mRNA外源序列，在对这一序列进行人工缺失后引起BDVD NADL株由CP型转变为非致细胞病变型(Non-cytopathogenic，NCP)。后经研究发现这一外源序列来自宿主细胞的热应激蛋白HSP40家族[2]，所编码的蛋白可与BVDV非结构蛋白NS2相互作用，促进NS2-3蛋白前体的裂解，进而引起细胞产生病变(Cytopathogenic effect，CPE)[3]。猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)作为与BVDV同属病毒，在自然界中并未发现有Jiv序列插入的嵌合病毒株，但是通过人工构建嵌合CSFV Alfort-Jiv株感染SK-6细胞后发现，病毒NS3蛋白和RNA大量增加，同时引起细胞病变(CPE)[4]。更为有趣的是，CSFV Alfort-Jiv株可以引起猪体内产生高滴度的中和抗体，并保护由CSFV引起的死亡，这一结果与自然界存在的其他CP型CSFV可以引起猪的典型猪瘟临床症状正好相反[5]。同时，本实验室前期研究发现，对猪脐静脉血管内皮细胞内Jiv90基因进行过表达，接入CSFV后发现表达Jiv90基因的试验组细胞死亡率高于对照组[6]，说明无论是通过CSFV基因组插入Jiv90序列还是单纯过表达细胞内的Jiv90基因都会对CSFV的复制产生影响。郭抗抗等[7]筛选到1株稳定表达靶向干扰细胞内Jiv基因序列shRNA的细胞株，进行猪瘟接毒试验后，发现CSFV RNA含量明显降低。由此可见，Jiv蛋白可能对CSFV的复制和毒力有较大影响。目前，此方面研究都集中在从基因水平来探讨Jiv和Jiv90与CSFV的相互作用上，为了进一步揭示Jiv蛋白在抗猪瘟中的作用，急需相应的检测猪Jiv蛋白或Jiv90蛋白的抗体来满足试验需求。

本研究对猪Jiv基因的核心区进行了克隆，并构建其原核表达载体进行诱导表达，利用镍金属离子螯合层析柱(Ni-NTA His Resin柱)纯化表达蛋白，免疫新西兰白兔后，制备了抗猪Jiv多克隆抗体，为进一步鉴定Jiv蛋白功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 组织与试验动物 脾脏组织采自3日龄长白系CSFV阴性小猪，采集后置-80 ℃保存备用；12月龄雄性健康成年新西兰白兔2只，购自陕西杨凌某兔场，常规饲养。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、PrimeScriptTMRT Kit、pMD19-T 载体，购自TaKaRa公司；Pfu高保真扩增酶，购自Fermentas公司；胶回收试剂盒、高纯质粒小量提取试剂盒，购自北京百泰克生物公司；弗氏完全佐剂和弗式不完全佐剂、HRP标记的羊抗兔IgG二抗、牛血清白蛋白，购自Sigma公司；TMB底物溶液，购自北京天根生物公司；Ni-NTA His Resin柱，购自北京全式金生物公司；蛋白Marker，购自北京鼎国昌盛生物公司；E.coliDH5α、Rosetta(DE3)菌株、原核表达载体pET-32a(+)，均由西北农林科技大学动物医学院畜禽疫病防治与畜产品安全实验室保存。

1.2 方 法

1.2.1 引物设计与合成 针对猪Jiv基因最大ORF序列用Primer Premier 6.0引物设计软件设计2对引物，克隆用引物：上游引物JivF 5′-ATGGCCCAGAAGCACCCC-3′，下游引物JivR 5′-ACGTTGGAAGGGCCTCCTC-3′；表达用引物：上游引物 Jivf 5′-GAAGATCTCATGGCCCAGAAGCACCC-3′(下划线为BglⅡ酶切位点)，下游引物 Jivr 5′-CCCAAGCTTACGTTGGAAGGGCCTCC-3′(下划线为Hind Ⅲ酶切位点)。引物由北京华大基因公司合成。

1.2.2 猪Jiv基因序列的扩增与原核载体的构建 用Trizol法从猪脾脏组织中提取RNA，按反转录试剂盒说明反转录合成cDNA。以cDNA为模板，JivF和JivR为上、下游引物，利用Pfu高保真扩增酶进行PCR扩增，同时设立阴性对照(以ddH2O代替cDNA模板)。PCR扩增体系25 μL：5×Pfubuffer with MgSO42.5 μL，dNTPs (各2 mmol/L) 2.5 μL，JivF (10 μmol/L) 1.0 μL，JivR (10 μmol/L) 1.0 μL，cDNA 1 μg，Pfu高保真扩增酶0.5 μL，ddH2O加至25 μL。反应条件如下：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。按胶回收试剂盒说明纯化PCR产物。对于纯化后PCR产物，进行末端加poly(A)尾。反应体系20 μL：2×TaqMix 10 μL，PCR产物10 μL。反应条件如下：72 ℃延伸30 min。将加poly(A)尾后的产物与pMD19-T载体粘性连接，构建pMD19T-Jiv质粒，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，挑取菌落PCR结果为阳性的单克隆菌落进行扩大培养，并提取阳性菌液质粒，送北京华大基因公司测序。

以质粒pMD19T-Jiv为模板，Jivf和Jivr为上、下游引物，利用Pfu高保真扩增酶进行PCR扩增目的基因，反应体系和程序同上，将PCR产物和pET-32a(+)分别用BglⅡ、Hind Ⅲ进行双酶切，酶切产物纯化回收后利用T4 DNA连接酶于16 ℃连接过夜，构建pET32a-Jiv载体。将连接产物转化Rosetta(DE3)感受态细胞。经菌落PCR初步鉴定后，挑取阳性单克隆菌落摇菌培养后提取质粒，进行BglⅡ/Hind Ⅲ双酶切鉴定及序列测定(测序由北京华大基因公司完成)。

1.2.3 猪Jiv蛋白序列分析 应用DNA Star软件(lasergene7.0)对克隆获得的猪Jiv基因序列进行分析，预测分析其蛋白的疏水性、抗原指数和表面分布可能性。

1.2.4 猪Jiv融合蛋白的诱导表达及纯化、复性 将原核表达载体pET32a-Jiv转化Rosetta(DE3)感受态细胞进行培养，待培养物OD600为0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L诱导表达4 h。取诱导表达产物，4 ℃超声(10 s/10 s，10 min)破碎细胞后对表达产物进行SDS-PAGE分析，并设立诱导的pET-32a(+)和未诱导的pET32a-Jiv为对照。待出现与预期分子质量大小相符的蛋白条带后，对融合蛋白最佳表达条件进行摸索，包括最佳IPTG诱导浓度(0.1，0.3，0.5，0.8，1.0 mmol/L)和最佳诱导时间(2，4，6，8和10 h)，分别按照上述条件诱导融合蛋白的表达，取诱导表达产物，进行SDS-PAGE分析，同时设立诱导的pET-32a(+)和未诱导的pET32a-Jiv为对照。

在最佳表达条件下对阳性菌液进行大体积诱导培养，取诱导后的菌液，室温下5 000 r/min离心10 min，收集上清液，用PBS清洗重悬细菌沉淀，4 ℃超声(10 s/10 s，30 min)破碎细胞后12 000 r/min离心10 min，弃上清液，收集包涵体沉淀。用Buffer B (100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素)室温下孵育溶解包涵体1 h，12 000 r/min 离心30 min，弃去沉淀，取上清液准备过Ni-NTA His Resin柱。先用Buffer B对柱子进行预平衡，加入2 mL上清液样品于柱中，在室温下摇晃30 min，后用4倍柱体积的Buffer C(100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L 咪唑，8 mol/L 尿素 )洗去杂蛋白，再用2倍柱体积Buffer E(100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L 咪唑，8 mol/L 尿素)洗柱4次，收集目的蛋白，对纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE分析，同时设立诱导的pET-32a(+)、未诱导的pET32a-Jiv和纯化前诱导的pET32a-Jiv作为对照。将收集的纯化后融合蛋白转入透析袋中，在4 ℃条件下将透析袋分别放入不同浓度尿素(6，4，2和1 mol/L)的透析液B (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)中进行由高到低梯度透析复性，每个浓度透析12 h，并用磁力搅拌器搅拌。再分别用透析液C(20 mmol/L Tris-HCl，0.6 mmol/L L-精氨酸，100 g/L蔗糖，2 mmol/L EDTA，0.5 mol/L尿素)和透析液D(20 mmol/L Tris-HCl,25 mmol/L NaCl，0.2 mol/L 尿素)透析12 h，透析完成后用PEG8000浓缩蛋白，于-20 ℃分装保存。

1.2.5 多克隆抗体的制备 用纯化后的猪Jiv融合蛋白免疫新西兰白兔，初次免疫蛋白量为400 μg/只，同时加入等体积的弗氏完全佐剂，完全乳化后分点注射于肩部皮下；后续4次加强免疫量为500 μg/只，并混入等体积的弗氏不完全佐剂，完全乳化后分点注射于背部皮下。每次免疫间隔2周。最后一次免疫后1周耳缘静脉采集血样，利用间接ELISA法测定血清效价，满足试验需求后处死动物，采集多抗血清，并在-20 ℃分装保存。

1.2.6 抗体效价的间接ELISA法测定 以纯化得到的猪Jiv融合蛋白样品作为抗原包被ELISA板，每孔加入100 μL抗原(质量浓度为0.1 μg/μL)，4 ℃过夜包被。次日弃去孔内液体，用300 μL 洗涤液(0.01 mol/L、pH 7.4 PBS，0.05% Tween-20)洗涤5次，每次3 min。每孔加入封闭缓冲液(体积分数1.5% 牛血清白蛋白)300 μL，37 ℃封闭1 h；弃去封闭缓冲液，用洗涤液洗涤5次，加入不同稀释度的本试验制备的多克隆抗体血清(梯度稀释1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800，1∶25 600)，同时设立空白对照(用PBS代替多克隆抗体血清)和每个稀释度的阴性血清对照(未进行猪Jiv融合蛋白免疫的兔血清)，37 ℃孵育1 h；弃去孔内液体，加入洗涤液反复洗涤5次，每次3 min；每孔加入100 μL HRP标记的羊抗兔IgG二抗 (1∶5 000稀释)，37 ℃孵育1 h；弃去液体，用洗涤液洗涤5次后，加入100 μL TMB底物溶液作用30 min，再加入100 μL终止液(2 mmol/L H2SO4)，用酶标仪(用空白对照调零)测定各孔OD450，以免疫血清样品OD450≥2倍阴性对照血清OD450时的最大稀释度作为该抗体的效价检测。

1.2.7 抗体特异性的Western blot分析 将猪脾脏组织裂解上清液、纯化的猪Jiv融合蛋白用于SDS-PAGE电泳，同时以牛血清白蛋白作为阴性对照。电泳后，将蛋白电转到硝酸纤维膜上，多克隆抗体以1∶500稀释，进行Western blot检测。

2 结果与分析

2.1 猪Jiv基因的克隆及原核表达载体的构建

从猪脾脏组织中提取总RNA后反转录合成cDNA，以cDNA为模板PCR扩增到1条2 000 bp左右的片段(图1)。将Jiv基因连接到pMD19-T载体，转化E.coliDH5α，对菌落PCR鉴定结果阳性的单菌落扩大培养，提取阳性菌液质粒，测序后发现，本试验克隆的Jiv与NCBI中已有猪源Jiv序列(登录号：NM_001185066.1)一致，长度为2 112 bp。pET32a-Jiv原核表达载体经双酶切鉴定，获得了5 900和2 112 bp的片段(图2)；测序分析发现，本试验克隆的Jiv核苷酸序列与已报道的猪Jiv序列100%相符，说明原核表达载体pET32a-Jiv构建成功。

2.2 猪Jiv蛋白序列分析

利用DNA Star软件对获得的猪Jiv蛋白进行序列分析，发现在241～386段具有较高的疏水性，同时此段也具有较低的抗原指数，可能预示此处为一段跨膜区域。Jiv蛋白的N端和C端有较高的亲水性、抗原指数和表面分布可能性(图3)。综合分析预测结果，Jiv蛋白的N端和C端都有可能是B细胞识别位点，因此Jiv蛋白可以作为潜在抗原引起免疫动物产生免疫反应。

2.3 猪Jiv融合蛋白的诱导表达及其可溶性分析

结果显示，经IPTG诱导后，菌体表达出现大量分子质量为95 ku的产物，主要以包涵体的形式存在(图4)。

2.4 猪Jiv融合蛋白诱导表达条件的优化

利用不同浓度IPTG诱导融合蛋白的表达，结果显示,当IPTG终浓度超过0.5 mmol/L时，重组蛋白表达增长缓慢，考虑到IPTG存在一定的细胞毒性，所以选取0.5 mmol/L为最佳诱导剂终浓度(图5)；对含有pET32a-Jiv的Rosetta(DE3)菌株进行不同时间的诱导表达，结果显示，当连续诱导后6 h后，重组蛋白表达量基本稳定(图6)，因此确定最佳诱导时间为6 h。

图3 猪Jiv蛋白序列的亲水性、抗原指数和表面分布可能性分析
Fig.3 Analysis of hydrophilicity,antigenic index and surface probability of swine Jiv protein

2.5 猪Jiv融合蛋白的纯化

使用Ni-NTA His Resin柱纯化目的蛋白，在95 ku处出现一条带，其大小与理论值相符(Jiv蛋白分子质量为78 ku，His标签蛋白分子质量为17 ku)，同时样品蛋白所含杂带较少，说明最终纯化到的目的蛋白纯度较高(图7)，可以作为抗原免疫动物。

图6 诱导时间对猪Jiv融合蛋白诱导表达的影响
M.蛋白质分子质量标准;1.诱导的pET-32a(+);2.未诱导的pET32a-Jiv;3～7.分别诱导2,4,6,8,10 h的pET32a-Jiv
Fig.6 Effects of induction time on expression of Jiv fusion protein
M.Protein Marker;1.Induced cells containing pET-32a(+);2.Uninduced cells containing pET32a-Jiv;3-7.Cells containing pET32a-Jiv induced for 2,4,6,8 and 10 h,respectively

图7 纯化猪Jiv融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果
M.蛋白质分子质量标准;1.诱导的pET-32a(+); 2.未诱导的pET32a-Jiv;3.纯化前诱导的pET32a-Jiv; 4.纯化的猪Jiv融合蛋白
Fig.7 Analysis of purified swine Jiv fusion protein by SDS-PAGE
M.Protein Marker;1.Induced cells containing pET-32a(+); 2.Uninduced cells containing pET32a-Jiv;3.Induced cells containing pET32a-Jiv;4.Purified His-Jiv fusion protein

2.6 抗猪Jiv蛋白多克隆抗体血清的效价

用间接ELISA法测定抗体效价，结果显示，抗猪Jiv蛋白多克隆抗体血清的效价较高，达1∶6 400(图8)。

图8 抗猪Jiv蛋白多克隆抗体血清的效价
Fig.8 Titers of polyclonal antibody against swine Jiv protein

2.7 抗猪Jiv蛋白抗体特异性的检测

用Western blot检验抗猪Jiv蛋白多克隆抗体的特异性，结果显示，自制的多克隆抗体与Jiv融合蛋白和组织中的猪Jiv蛋白发生反应均产生分子质量正确的蛋白条带，与非特异性蛋白未发生反应(图9)，说明抗体有良好特异性。

3 讨 论

Jiv蛋白作为宿主细胞分子伴侣蛋白HSP40家族的一个成员，其与病毒的相互作用不断被人们所关注。Jiv蛋白可以促进瘟病毒属(Pestivirus)成员BVDV非结构蛋白NS2-3前体蛋白的切割，进而促进病毒复制，最终影响BVDV的表型[3]，其也参与黄病毒属(Flavivirus)成员黄热病病毒(Yellow fever virus,YFV)的病毒复制复合体的形成[8]，大量表达Jiv蛋白后可减少由YFV引起的细胞死亡[9]。而这些病毒都与人类生命健康和动物健康息息相关[10-11]。

目前研究发现，在Jiv蛋白与CSFV相互作用过程中，已经可以确定Jiv90区段与CSFV NS2蛋白发生结合，促使NS2发挥蛋白酶作用切割NS2-3蛋白前体[4]，释放出的NS3蛋白进一步发挥其蛋白酶作用并产生放大效应，引起与病毒复制相关非结构蛋白NS4A、NS5A、NS5B在病毒感染细胞初期大量累积[12-13]，为病毒的快速复制创造条件[14]，类似的机制在Jiv蛋白与BVDV相互作用过程中也有报道[3,15]。在CSFV基因组中插入Jiv90后构建的嵌合Alfort-Jiv毒株并未引起被感染宿主的大量死亡，反而引起机体产生中和CSFV的高滴度抗体，有效地保护了宿主，其对应的NCP型CSFV Alfort-p447株感染宿主后则产生了典型猪瘟临床症状[4]。CP型CSFV vA187-1毒株也可引起被感染细胞产生CPE效应，其基因序列中没有Jiv序列的插入，其病毒RNA复制、非结构蛋白NS3的表达动力学以及引起的猪瘟临床症状并未与相对应的NCP型CSFV vA187-1株有明显差异[16-17]。说明CSFV Alfort-Jiv毒株与宿主相互作用过程中存在其特殊性，提示这种特殊性可能是由于Jiv序列的插入引起的，因此笔者推断，Jiv插入引起的CP型CSFV与宿主之间存在更为复杂的作用网络，可能参与了宿主的免疫调节反应。

谭学超等[18]发现，Jiv基因在猪体不同组织脏器中存在不同表达分布，在猪瘟病毒靶组织(如脾脏)中，Jiv基因表达量显著高于非靶组织。因此，本研究在提取JivRNA时，选取其表达量高的猪脾脏组织作为材料，经过RT-PCR后获得浓度较高的JivDNA。为了深入研究Jiv蛋白与CSFV的相互作用，以及可能参与到的宿主免疫调节功能，本试验构建了pET32a-Jiv原核表达载体，纯化了猪Jiv融合蛋白并制备相应的特异性抗体，为后续蛋白功能研究提供了基础材料。

[1] Mendez E,Ruggli N,Collett M S,et al.Infectious bovine viral diarrhea virus (strain NADL) RNA from stable cDNA clones:A cellular insert determines NS3 production and viral cytopathogenicity [J].J Virol,1998,72(6):4737-4745.

[2] Hughes A L.Evolutionary origin of theJiv90 gene of pestivirus [J].Infection,Genetics and Evolution,2004,4(4):329-333.

[3] Rinck G,Birghan C,Harada T,et al.A cellular J-domain protein modulates polyprotein processing and cytopathogenicity of a pestivirus [J].J Virol,2001,75(19):9470-9482.

[4] Gallei A,Blome S,Gilgenbach S,et al.Cytopathogenicity of cla-ssical swine fever virus correlates with attenuation in the natural host [J].J Virol,2008,82(19):9717-9729.

[5] Kosmidou A,Büttner M,Meyers G.Isolation and characterization of cytopathogenic classical swine fever virus (CSFV) [J].Archives of Virology,1998,143(7):1295-1309.

[6] 刘 伟,杨幼聪,李宇立,等.分子伴侣Jiv90基因的克隆及其在猪脐静脉血管内皮细胞中的表达 [J].动物医学进展,2010,31(6):26-30.

Liu W,Yang Y C,Li Y L,et al.Cloning of molecular chaperoneJiv90 gene and its expression in SUVEC line [J].Progress in Veterinary Medicine,2010,31(6):26-30.(in Chinese)

[7] 郭抗抗,雷安民,宁蓬勃,等.转录靶向猪Jiv基因 shRNA 细胞株的建立及抗猪瘟病毒转基因猪的构建 [J].中国农业科学,2013,46(1):170-178.

Guo K K,Lei A M,Ning P B,et al.Establishment of cell lines transcribing shRNA targeted toJivgene and constuction of CSFV resistant transgenic Piglet [J].Scientia Agricultura Sinica,2013,46(1):170-178.(in Chinese)

[8] Yi Z,Yuan Z,Rice C M,et al.Flavivirus replication complex assembly revealed by DNAJC14 functional mapping [J].J Virol,2012,86(21):11815-11832.

[9] Yi Z,Sperzel L,Nürnberger C,et al.Identification and characterization of the host protein DNAJC14 as a broadly active flavivirus replication modulator [J].PLoS Pathog,2011,7(1):e1001255.

[10] Monath T P.Yellow fever and dengue-the interactions of virus,vector and host in the re-emergence of epidemic disease [J].Seminars in Virology,1994,5(2):133-145.

[11] Gunn G,Saatkamp,Humphry R,et al.Assessing economic and social pressure for the control of bovine viral diarrhoea virus [J].Preventive Veterinary Medicine,2005,72(1):149-162.

[12] Xiao M,Zhang C Y,Pan Z S,et al.Classical swine fever virus NS5B-GFP fusion protein possesses an RNA-dependent RNA polymerase activity [J].Archives of Virology,2002,147(9):1779-1787.

[13] Moulin H R,Seuberlich T,Bauhofer O,et al.Nonstructural proteins NS2-3 and NS4A of classical swine fever virus:Essential features for infectious particle formation [J].Virology,2007,365(2):376-389.

[14] Lamp B,Riedel C,Roman-Sosa G,et al.Biosynthesis of classical swine fever virus nonstructural proteins [J].J Virol,2011,85(7):3607-3620.

[15] Lackner T,Müller A,König M,et al.Persistence of bovine viral diarrhea virus is determined by a cellular cofactor of a viral autoprotease [J].J Virol,2005,79(15):9746-9755.

[16] Mittelholzer C,Moser C,Tratschin J D,et al.Generation of cytopathogenic subgenomic RNA of classical swine fever virus in persistently infected procine cell lines [J].Virus Res,1997,51(2):125-137.

[17] Mittelholzer C,Moser C,Tratschin J D,et al.Analysis of classical swine fever virus replication kinetics allows differentiation of highly virulent from avirulent strains [J].Vet Microbiol,2000,74(4):293-308.

[18] 谭学超,郭抗抗,宁蓬勃,等.检测猪分子伴侣Jiv基因的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法的建立 [J].中国预防兽医学报,2013,35(11):894-898.

Tan X C,Guo K K,Ning P B,et al.Development of SYBR Green Ⅰ fluorogenetic quantitative RT-PCR assay for detection of porcine molecular chaperoneJiv[J].Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine,2013,35(11):894-898.(in Chinese)

Cloning and expression of swineJivgene and preparation of its polyclonal antibody

LIU Wei,GUO Kang-kang,LIN Zhi,SHENG Jie,ZHAO Di,ZHAO Zi-yin,ZHANG Yan-ming

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study aimed to clone the 2 112 bpJivgene from core area of swine Jiv protein,construct the prokaryotic expression vector for the expression and purification of fusion protein,and prepare polyclonal antibody against swine Jiv protein.【Method】 TheJivgene was amplified by RT-PCR from swine spleen tissues and cloned into pMD19-T vector to sequence.It also acted as template to construct prokaryotic expression vector pET32a-Jiv and the recombinant vector was transformed intoE.coliRosetta (DE3).Swine Jiv fusion proteins with the inclusion form were obtained inducing by IPTG and were purified by Ni2+charged column.After purification,inclusion body was refolded through dialysis renaturation.400 μg protein was injected into each New Zealand white rabbit as the first immunization and 500 μg protein as strengthening immunization was used for a total of five times.When titers of antibodies detected by indirect ELISA reached a certain level,the antibodies were collected and identified by Western blot.【Result】 The fragment of swineJivgene with the length of 2 112 bp was successfully obtained.The constructed pET32a-Jiv was highly expressed inE.coliRosetta (DE3) after induction by IPTG.SDS-PAGE showed that the purified fusion protein was about 95 ku.The titer of antibodies was 1∶6 400 and Western blot showed that the obtained antibodies could be used to detect swine Jiv protein effectively.【Conclusion】 SwineJivgene was cloned and the polyclonal antibodies against swine Jiv protein were prepared.

swine Jiv protein;prokaryotic expression;polyclonal antibody;classical swine fever virus

2013-10-18

西北农林科技大学基本科研业务费项目(QN2011109)； 国家自然科学基金项目(31172339)

刘 伟(1987-)，男，陕西户县人，在读硕士，主要从事分子病原学研究。E-mail：liuwei2001@126.com

张彦明(1956-)，男，陕西南郑人，教授，博士生导师，主要从事分子病原学与病毒致病机理研究。 E-mail：zhangym@nwsuaf.edu.cn

时间:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.027

S852.65+1；Q785

A

1671-9387(2015)02-0007-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.027.html