羊口疮病毒新疆流行株的分离鉴定及其遗传进化分析

杨海波，孟庆玲，乔 军，才学鹏，贺志昊，刘昱成，彭叶龙，王国超，陈创夫，都曼·努尔坎杰

(1 石河子大学 动物科技学院 动物疾病防控兵团重点实验室，新疆 石河子 832003；2 中国农业科学院 兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学重点实验室，甘肃 兰州 730046;3 沙湾县畜牧兽医站，新疆 沙湾 832100)

羊口疮病毒新疆流行株的分离鉴定及其遗传进化分析

杨海波1，孟庆玲1，乔 军1，才学鹏2，贺志昊1，刘昱成1，彭叶龙1，王国超1，陈创夫1，都曼·努尔坎杰3

(1 石河子大学 动物科技学院 动物疾病防控兵团重点实验室，新疆 石河子 832003；2 中国农业科学院 兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学重点实验室，甘肃 兰州 730046;3 沙湾县畜牧兽医站，新疆 沙湾 832100)

【目的】 研究羊口疮病毒(Orf virus，ORFV)新疆流行株的遗传变异情况。【方法】 采集新疆石河子地区疑似感染ORFV的羔羊唇部结痂病料，通过PCR扩增、Vero传代细胞分离培养、电镜观察、动物回归试验等方法，检测、分离和鉴定ORFV毒株，对分离鉴定的3株ORFV毒株保护性抗原基因B2L和F1L及毒力基因VIR、GIF和VEGF分别进行克隆、测序及遗传进化分析。【结果】 从病料中分离鉴定出3株ORFV新疆流行株(ORFV-SHZ1、ORFV-SHZ2和ORFV-SHZ3)。分析结果显示，ORFV分离株保护性抗原基因B2L、F1L相对保守，B2L和F1L基因编码氨基酸序列与其他参考株的同源性分别为88.6%～97.9%和86.7%～97.4%；3个毒力基因的变异相对较大，尤其是VEGF基因。VIR、GIF和VEGF基因编码氨基酸序列与其他参考株的同源性分别为91.8%～97.3%，85.2%～97.0%和71.5%～98.5%。基于B2L和VIR基因的遗传进化树分析表明，ORFV-SHZ1和ORFV-SHZ2分离株均与台湾分离株的亲缘关系最近。【结论】 试验分离的ORFV新疆流行株可能是由台湾株与其他毒株重组后产生的，且其毒力基因发生了较大的变异。

羊口疮病毒；分离鉴定；遗传进化分析；新疆

羊口疮又称羊接触传染性脓疱皮炎或传染性脓疮，是由羊口疮病毒(Orf virus，ORFV)所引起的一种绵羊和山羊的接触性传染病。该病毒为双链DNA病毒，基因组长约140 kb，G+C含量达64%[1]，是痘病毒科、副痘病毒属的代表种。副痘病毒属成员还包括小牛侵蚀性口炎病毒(Bovine pustular stomatitis virus，BPSV)、伪牛痘病毒(Pseudo-cowpox virus，PCPV)和新西兰红鹿副痘病毒(Parapox virus of red deer in New Zealand，PVNZ)[2-3]。

ORFV主要感染小反刍动物如山羊和绵羊，偶尔也感染其他野生反刍动物，如鹿、麝牛等，其中以羔羊最为易感，常引起群体发病，尤其是饲养密集的羊群[4]，口疮的临床特征是在唇部、舌、鼻端、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和痂皮。此外，本病是一种人兽共患传染病，可通过直接接触感染人[5]。据报道，该病发病率接近50%，敏感羊群的发病率则可接近90%，因此一旦发生该病，在给养羊业造成巨大经济损失的同时也直接威胁着人类的健康。

疫苗接种是预防和控制口疮病发生的有效手段。然而，近年来有研究报道弱毒疫苗免疫后，不能提供有效的保护，出现免疫失败和重复感染的现象，推测不同地域ORFV流行株存在遗传变异。养羊业一直是新疆牧民的主要产业，近年来，随着养殖规模的扩大和饲养方式的转变，羊口疮在新疆各地羊群中呈暴发性流行，在易感羊群中发病率可达90%，羔羊感染后的死亡率可达30%以上[6]，给新疆养羊业造成了较大的经济损失。本研究对在新疆石河子地区分离出的3株ORFV的2个保护性抗原基因和3个毒力基因分别进行克隆、测序及遗传进化分析，旨在从分子水平上揭示ORFV新疆流行株的遗传变异规律，为新疆地区ORFV的科学防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病料的采集与处理 于2012-06-2013-07在新疆石河子市周边羊场采集3～4月龄疑似发生口疮病羔羊的唇部结痂及口腔黏液备用。

对采集的山羊口唇处痂块用无菌生理盐水漂洗3次后剪碎、研磨并以无菌生理盐水按体积比为 1∶10 制成悬液，加青霉素、链霉素各2 000 IU/mL,置4 ℃冰箱过夜,以5 000 r/min 离心10 min,取上清液用于后续试验。

1.1.2 细胞系与菌株 Vero细胞和DH5α感受态细胞均由石河子大学动物疾病防控兵团重点实验室保存。

1.1.3 主要试剂与仪器 主要试剂：胎牛血清和细胞培养基DMEM购自Hyclone公司，青霉素、链霉素、0.22 μm滤器、限制性内切酶SmaⅠ、T4 DNA 连接酶、PCR反应试剂、pMD18-T载体、总DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒和DNA Marker均购自 TaKaRa 公司。

主要仪器：PCR仪、超速离心机、超级数显恒温器、透射电子显微镜、凝胶成像仪、恒温细胞培养箱、恒温摇床。

1.2 ORFV的PCR检测

1.2.1 引物的设计与合成 参照GenBank公布的ORFV保护性抗原基因B2L(GenBank登录号：HM466933.1)的序列，用Primer 5.0软件设计1对特异性引物(表1)，引物由北京华大基因合成。

1.2.2 DNA的提取和B2L基因的PCR扩增 用总DNA提取试剂盒抽提病毒DNA，以其为模板用B2L基因引物进行PCR扩增，引物序列见表1。反应体系为:10×buffer(含MgCl2)2.0 μL，2.5 mmol/mL dNTP 0.6 μL，20 mmol/mL上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，TaqDNA 聚合酶(2.5 U/mL)0.5 mL，用DEPC处理过的双蒸水补足体积至20 μL。反应条件为:95 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性50 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环； 最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳，观察PCR扩增结果。

1.3 病毒分离

取1.1.1中的病料处理上清液1 mL接种于生长良好的Vero细胞，37 ℃吸附2 h，中间每隔20 min轻摇1次细胞瓶，吸附完成后弃去上清液，加入含体积分数2%胎牛血清的DMEM细胞维持液，于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱静置培养，每天观察细胞病变效应(CPE)。如果在接种病料后4～5 d内细胞没有出现CPE，连续盲传3代，传至第5代还未出现CPE，即可判定相应的ORFV病料为阴性。

1.4 病毒学鉴定

收集出现CPE的细胞培养物，反复冻融3次，3 000 r/min离心20 min，取含有病毒的上清液用2%磷钨酸溶液(2 g磷钨酸溶于100 mL双蒸水)负染后用电镜进行形态学观察。用纯化的病毒液划痕接种于2月龄试验羊唇部，每只接种0.5 mL，同时设对照组，对照组以同样的方法接种无菌PBS 0.5 mL。接种后每天对接种部位进行病变观察，进行动物回归试验。

1.5 ORFV 新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF及VEGF基因的扩增与克隆

参照GenBank公布的ORFV保护性抗原基因F1L(GenBank登录号：AY040081.1)及毒力基因GIF(GenBank登录号：DQ922634.1)、VIR(GenBank登录号：AY386264.1)和VEGF(GenBank登录号：AF106020.1)的序列，用Primer 5.0软件分别设计合成4对特异性引物，引物序列见表1。以总DNA提取试剂盒抽提病毒基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系同1.2.2，反应条件为:95 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性50 s，54～62 ℃(具体退火温度以扩增基因而定，F1L、VIR、GIF、VEGF和B2L基因退火温度分别为 62，55，59，54和60 ℃)退火35 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。将PCR扩增产物分别用DNA凝胶回收试剂盒回收，然后分别与pMD18-T载体连接，并转化到DH5α感受态细胞中，扩菌培养后，通过菌液PCR进一步筛选验证阳性克隆。每个基因挑取鉴定正确的克隆送北京华大基因公司测序。

1.6 ORFV 新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF及VEGF基因的测序与遗传进化分析

分别从GenBank上下载已登录的基因序列，应用DNAStar及MEGA 5.0软件分别对获得的3株ORFV新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF及VEGF5个基因的测序结果进行氨基酸同源性和遗传进化树分析。

2 结果与分析

2.1 ORFV B2L基因的PCR检测

以从病料中提取的病毒基因组DNA为模板，用B2L基因的特异性引物进行PCR扩增，获得长度约为1 137 bp的扩增片段(图1)，与预期的DNA片段长度相符。

2.2 ORFV的分离

用Vero细胞从患病羔羊唇部痂皮中分离获得了3株ORFV新疆流行株，分别命名为ORFV-SHZ1、ORFV-SHZ2和ORFV-SHZ3。ORFV-SHZ分离株接种前5代细胞上的CPE不太明显，盲传至第5代时细胞出现变圆、收缩和聚堆等现象(图2)，随着连续的传代，细胞病变越来越明显，可见细胞脱落的“拉网状病变”。ORFV-SHZ1在Vero细胞上引起的细胞病变效应(CPE)见图2。

2.3 ORFV的鉴定

通过电镜观察可见典型的痘病毒粒子，直径达200 nm左右。病毒粒子外观呈椭圆形、有囊膜，病毒粒子表面有绳索样结构缠绕。ORFV-SHZ1株的电镜负染观察结果见图3。用0.5 mL纯化病毒液划痕接种于2月龄试验羊唇部，接种后1周在其口角和唇部等部位出现丘疹、脓疱，以后逐渐结痂愈合。接种ORFV-SHZ1的动物临床症状见图4。对照组未见任何病变。

2.4 ORFV 新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF 及 VEGF基因的克隆

以从细胞收毒液中提取的ORFV-SHZ分离株的病毒基因组DNA为模板，对B2L、F1L、GIF、VIR和VEGF基因进行PCR扩增，分别获得长度约为1 137，1 023，798，552和402 bp的扩增片段，与预期的DNA片段长度相符。ORFV-SHZ1株B2L、F1L、GIF、VIR和VEGF基因的PCR扩增结果见图5。测序结果显示，以上扩增的5个基因均为目的基因。

2.5 ORFV 新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF及VEGF基因编码氨基酸的同源性分析

分析结果表明，ORFV保护性抗原基因B2L、F1L相对保守，ORFVB2L和F1L基因编码氨基酸序列与其他参考株的同源性分别为88.6%～97.9%和86.7%～97.4%；毒力基因VIR、GIF、VEGF的变异相对较大，尤其是VEGF基因。VIR、GIF和VEGF基因编码氨基酸序列与其他参考株的同源性分别为91.8%～97.3%，85.2%～97.0%和71.5%～98.5%。ORFV-SHZ株VEGF基因氨基酸序列与ORFV-Ena、ORFV-GE、ORFV-HIS、ORFV-IJS081、ORFV-IT-C2、ORFV-IT-TO、ORFV-NA1-11、ORFV-NZ2、ORFV-Orf-119、ORFV-OVIA82、ORFV-Aichi和ORFV-D1701等12个参考株的氨基酸序列比对结果如图6所示。

2.6 ORFV新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF及VEGF基因的遗传进化分析

基于GIF基因的遗传进化树显示，ORFV-SHZ分离株均与印度分离株(ORFV-MUK59-55)的亲缘关系最近；基于VEGF的遗传进化树显示，3株ORFV-SHZ分离株均与新西兰分离株(ORFV-NZ2)的亲缘关系最近 (图7) ；基于B2L和VIR基因的遗传进化树分析表明，ORFV-SHZ1和ORFV-SHZ2 分离株均与台湾分离株(ORFV-Nantou/ORFV-Hoping)的亲缘关系最近(图8和图9)；F1L基因的遗传进化树显示，分离的3株ORFV分布于2支，其中ORFV-SHZ1、ORFV-SHZ3分别与意大利分离株ORFV-OV Torino和ORFV-OV-C2聚为一支，ORFV-SHZ2与美国分离株(ORFV-OV-SAOO)的亲缘关系较近，聚为一支(图9和图10)。

3 讨 论

羊口疮是一种重要的人畜共患传染病，可引起人和动物发生传染性接触性皮炎，且传播速度快，传染范围广，对养羊业危害最为严重。近年来，该病在世界各地的发生呈不断上升趋势，ORFV感染的宿主范围在逐渐扩大[7]。疫苗接种是预防和控制该病发生的有效手段。当前国内外主要使用常规的弱毒疫苗对该病进行免疫防治。这些疫苗能在一定程度上降低感染率，被证实是安全有效的。然而，近年来有研究报道弱毒疫苗免疫后，不能提供有效的保护[8]，推测ORFV流行株可能发生了遗传变异。Oem等[9]分别在2009和2012年对韩国ORFV分离株ORF/09、ORF/2011株进行遗传进化分析，结果显示B2L和VIR基因存在着变异，并指出ORFV感染宿主有从奶山羊向黑山羊过渡的趋势；Chan等[10]对台湾ORFV分离株的研究结果表明，ORFV-A32L基因存在有较大变异；Li等[11]对ORFV-Nongan分离株NA1/11的遗传进化研究结果显示，ORFV110和ORFV132(VEGF)基因均发生了较大的变异。本试验分别对ORFV分离株的2个保护性抗原基因和3个毒力基因进行了克隆、测序及遗传进化分析，结果表明，ORFV新疆流行株存在着变异现象，尤其是毒力基因VEGF的变异最大，与GenBank上公布的其他参考株的VEGF编码氨基酸序列的同源性为71.5%～98.5%。基于B2L和VIR基因的遗传进化树显示，ORFV-SHZ1和ORFV-SHZ2与台湾分离株(ORFV-Nantou/ORFV-Hoping)的亲缘关系最近，因此推测ORFV新疆流行株可能是由台湾株与其他毒株重组后产生的。

目前，在ORFV上已经发现的毒力基因主要有VIR、vIL-10、GIF和VEGF。这些基因都位于ORFV基因组2个末端的反向重复序列中，属于ORFV基因组的易变区域[12]。研究发现，VIR基因编码的干扰素抑制蛋白，能抑制干扰素，在病毒感染早期发挥重要作用；vIL-10编码蛋白可诱发不同细胞产生免疫刺激或免疫抑制作用，是一种重要的免疫调节因子，具有抑制炎症介质产生、T细胞活化增殖及降低抗原递呈等作用，在病毒的免疫逃避机制中发挥着重要作用；VEGF编码的血管内皮生长因子在病毒感染的宿主中能引起血管内皮强烈增生和血管高度扩张[13]。GIF是一种特异性的双重细胞因子结合蛋白，能够与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-2(IL-2)结合，并抑制二者活性，且仅有副痘病毒属成员才具有编码GIF基因序列的功能[14]。到目前为止，对ORFV毒力基因遗传变异的研究报道还较少，尚不清楚这些毒力基因变异对其致病力的影响。因此，开展ORFV主要保护性抗原基因和毒力基因及其编码蛋白的研究，不仅有助于阐明ORFV遗传变异的规律和致病分子机理，而且可为该病的科学防控提供理论依据。

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Isolation,identification and phylogenetic analysis of Orf virus epidemic strains in Xinjiang

YANG Hai-bo1,MENG Qing-ling1,QIAO Jun1,CAI Xue-peng2,HE Zhi-hao1, LIU Yu-cheng1,PENG Ye-long1,WANG Guo-chao1,CHEN Chuang-fu1,NUERKANJIE Du-man3

(1KeyLaboratoryofPreventionandcontrolofAnimalDisease,DepartmentofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832003,China;2LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou,Gansu730046,China;3AnimalHusbandryandVeterinaryStation,Shawan,Xinjiang832100,China)

【Objective】 This study aimed to investigate the genetic evolution situation of Orf virus (ORFV) epidemic strains in Xinjiang.【Method】 Samples were collected from lamb with suspected ORFV infection in Shihezi region,and the strains were identified by PCR amplification,isolation and culture in Vero cell,electron microscopy,and animal regression.The major protective antigen genesB2LandF1Land virulence genesVIR,GIFandVEGFof the three identified ORFV were cloned,sequenced,and phylogenetically analyzed.【Result】 Three ORFV isolates(ORFV-SHZ1,ORFV-SHZ2,and ORFV-SHZ3) were isolated and identified from collected samples.ORFV protective antigen genesB2LandF1Lwere relatively conservative,sharing 88.6%-97.9% and 86.7%-97.4% identities in amino acid sequence with other reference strains.The virulence gene variation was significant,especially forVEGFgene.Amino acid identities ofVIR,GIFandVEGFgenes with other reference strains were 91.8%-97.3%,85.2%-97.0%,and 71.5%-98.5%,respectively.Phylogenetic tree analysis based onB2LandVIRgenes showed that ORFV-SHZ1 and ORFV-SHZ2 strains were close to isolates from Taiwan.【Conclusion】 Recombination occurred among Shihezi isolates,Taiwan strains and other strains, causing great variation in virulence genes.

Orf virus;isolation and identification;phylogenetic analysis;Xinjiang

2013-09-29

兵团国际科技合作计划项目(2012BC006)；国家农业公益行业专项子课题(201303037-5)

杨海波(1988-)，男，河南舞阳人，硕士，主要从事病原分子生物学研究。E-mail:yhb1988043@126.com

乔 军(1971-)，男，陕西榆林人，教授，博士，主要从事分子病毒学研究。E-mail:qj710625@163.com

时间:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.001

S852.65+4

A

1671-9387(2015)02-0014-09

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.001.html